Dokument: Einfluss von WRN und WRN-assoziierten und –unabhängigen Basenexzisionsreparaturfaktoren auf Endothelzellfunktionen

Titel:	Einfluss von WRN und WRN-assoziierten und –unabhängigen Basenexzisionsreparaturfaktoren auf Endothelzellfunktionen
Weiterer Titel:	Effect of WRN and WRN-associated and -independent base excision repair factors on endothelial cell functions
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=52836
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200409-131637-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Laarmann, Kathrin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,40 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.03.2020 / geändert 30.03.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Fritz, Gerhard [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Johannes Hegemann [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Atherosklerose ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Blutgefäßwand, die auf eine endotheliale Dysfunktion zurückgeht und durch eine Verdickung und Kalzifikation der Gefäßwand gekennzeichnet ist. Dabei sind reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species, ROS) maßgeblich an der Aktivierung pathologischer Signalwege beteiligt. Komplikationen dieser Erkrankung führen zu einer unzureichenden Nähr- und Sauerstoffversorgung der betroffenen Gewebe und haben Gewebeschäden zur Folge. Die Gründe für die Entstehung einer Atherosklerose sind multifaktoriell. Neben Umwelteinflüssen sind genetische Prädispositionen für die Entstehung vaskulärer Erkrankungen verantwortlich. Werner-Syndrom Patienten haben einen Defekt im Werner-Syndrom Gen (Wrn) und erkranken häufig bereits während der dritten Dekade ihres Lebens an Atherosklerose, die neben malignen Tumoren die häufigste Todesursache dieser Patienten darstellt. Das Werner-Syndrom Protein (WRN), eine DNA-Helikase, ist an der Reparatur von DNA-Basenschäden durch die Basenexzisionsreparatur (BER) beteiligt. DNA-Basenschäden entstehen u. a. durch ROS, wie sie vermehrt in atherosklerotischem Gewebe auftreten. Nach der Entstehung von DNA-Basenschäden entwindet WRN das zu reparierende Teilstück der DNA und interagiert mit Faktoren des BER-Weges. Daher ist die Arbeitshypothese, dass durch das Fehlen von WRN (bzw. BER-Faktoren) pathologische, DNA-schadenassoziierte Mechanismen aktiviert werden, welche zu endothelialen Fehlfunktionen führen. WRN und eine funktionierende BER würden demnach einer Akkumulation von Basenläsionen entgegenwirken und wären für die Aufrechterhaltung endothelzellspezifischer Funktionen von Bedeutung. Um dies zu untersuchen wurden WRN und/oder ausgewählte BER-Faktoren (APE1, FEN1, NEIL1, PARP1, OGG1) in EA.hy926 Hybridzellen sowie primären HUVEC mittels RNA-Interferenz herunterreguliert und der Einfluss auf ausgewählte Endothelzellfunktionen analysiert. Zusätzlich wurden die Endothelzellen mit schwach oder moderat zytotoxischen Konzentrationen des Oxidans tBHQ oder des Alkylanz MMS behandelt und im Anschluss ebenfalls hinsichtlich ihrer Funktionalität untersucht. Ein reduzierter WRN-Gehalt hatte keine unspezifischen zytotoxischen Effekte auf die untersuchten Endothelzellen zur Folge. Die Analysen der endothelzellspezifischen Funktionen ergaben, dass WRN keinen Einfluss auf die Aufnahme von acLDL hat und die Stabilität der endothelialen Barriere aufrechterhält. WRN unterstützt die endotheliale Zellmigration. Weiterführende Untersuchungen ergaben, dass die Proteinexpression von PTK2 in WRN-kd Zellen vermindert ist, was u. a. ursächlich für die verminderte Migration dieser Endothelzellen sein könnte. WRN wirkt der mRNA-Expression inflammations-assoziierter Faktoren (Adhäsionsmoleküle, Ccl2, Plat) entgegen und verringert die adhäsiven Eigenschaften des Endothels, die die Adhäsion von im Blutkreislauf zirkulierenden Molekülen an das Endothelium fördern. Aus den Untersuchungen ergab sich ein inflammations-assoziiertes Erscheinungsbild der Zellen mit vermindertem WRN-Gehalt. Als einziger der untersuchten BER-Faktoren beeinflusst OGG1 die Zell-Zell Adhäsion und die mRNA-Expression endothelzellspezifischer Faktoren in ähnlicher Weise wie WRN. Ebenso wie WRN unterstützen die WRN-assoziierten BER-Faktoren APE1, NEIL1 und PARP1 die Migration, während FEN1 und OGG1 hemmend auf diese wirken. Daraus kann geschlossen werden, dass die für APE1-, NEIL1- und PARP1-kd beobachteten Effekte spezifisch sind und diese nicht auf die klassische Rolle der untersuchten Faktoren in der BER zurückzuführen sind. Die Inkubation der Endothelzellen mit tBHQ induziert die mRNA- und Proteinexpression der Hämoxygenase 1. Die hier verwendeten niedrigen tBHQ- und MMS-Konzentrationen führen nicht zu einem erhöhten Zelltod. Allerdings werden an der DNA-Schadensantwort beteiligte Faktoren durch die Inkubation der Zellen mit tBHQ und MMS aktiviert. TBHQ und MMS wirken hemmend auf die Aufnahme von acLDL, während ausschließlich tBHQ die Zell-Zell Adhäsion stimuliert. Die mRNA-Expression von Ccl2 ist nach der Behandlung der Endothelzellen mit tBHQ ebenfalls erhöht. Daher scheint vor allem das Oxidans tBHQ inflammationsassoziierte Mechanismen zu stimulieren. Die Effekte der verwendeten Substanzen sind größtenteils unabhängig vom WRN-Proteingehalt der Zellen. Daher scheint WRN vor allem unter basalen Bedingungen zur Aufrechterhaltung der Endothelzellfunktionen beizutragen und alters-assoziierten Mechanismen entgegenzuwirken. Auch die untersuchten BER-Faktoren (APE1, NEIL1, PARP1, OGG1) tragen in unterschiedlichem Umfang zur Aufrechterhaltung der Endothelzellfunktionen bei. Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of blood vessels, which is initiated by endothelial dysfunction and leads to thickening and calcification of the vessel wall. Reactive oxygen species (ROS) are involved in activation of pathological, proatherogenic signalling pathways. Complications provoked by atherosclerosis are based on an insufficient nutrition and oxygen supply of the affected tissue, which leads to myocardial infarction and stroke. Atherosclerosis is a multifactorial disease, caused by environmental influences as well as genetic predisposition. The gene defect in Werner-Syndrome patients give rise to an early onset of atherosclerosis during the third decade of life. Besides cancer, atherosclerosis is the main cause of death of these patients. The Werner-Syndrome protein (WRN) DNA-helicase is involved in base excision repair (BER), which is activated by DNA base damage caused for instance by ROS. Abundant ROS formation occurs in atherosclerotic plaques activating inflammatory gene expression. During BER, WRN unwinds the DNA of the damaged area and interacts with various BER proteins to promote DNA repair. Based on these data we hypothezied, that a loss of WRN (or other BER-factors) leads to the activation of pathological, DNA-damage associated mechanisms, which cause endothelial dysfunction. WRN and a functional BER prevent accumulation of DNA base lesions and are essentiell for the maintenance of endothelial-specific functions. To this end, WRN and/or single BER factors (APE1, FEN1, NEIL1, PARP1, OGG1) of EA.hy926 cells and HUVEC were knocked down (kd) by RNA-interference technique. Subsequently, analysis of cell functionality was performed. Furthermore, endothelial cells were treated with slightly toxic and moderate toxic concentrations of the antioxidant tBHQ or the alkylating agent MMS, followed by the investigation of endothelial cell-specific functions. The reduced WRN content has no unspecific cytotoxic effects on endothelial cells. Analyses of endothelial cell specific functions reveal that WRN has no influence on acLDL uptake and maintains the stability of the endothelial barrier. Moreover, WRN supports endothelial cell migration. More detailed investigations show reduced protein levels of PTK2 in WRN-kd endothelial cells, which might cause the impaired migration of these cells. WRN keeps the mRNA expression of inflammation-related factors (adhesion molecules, Ccl2, Plat) low and works against the adhesion of circulating molecules to the endothelium. WRN-kd cells show inflammation-associated features. Amongst the investigated BER-factors, OGG1 is the only one that influences cell-cell adhesion and mRNA expression of endothelial-specific factors similar to WRN. As observed for WRN, the WRN-associated BER factors APE1, NEIL1 and PARP1 support endothelial cell migration, whereas it is hampered by FEN1 and OGG1. Due to this result, the observed effects might be specific and are not based on the classical role of the BER-factors in BER. The incubation of endothelial cells with tBHQ induce mRNA- and protein expression of heme oxygenase 1. Low-dose tBHQ and MMS concentrations show no increase in cells death. Both, tBHQ and MMS, activate factors of the DNA damage response. TBHQ and MMS have inhibitory effects on acLDL uptake, but only tBHQ stimulates cell-cell adhesion. The mRNA expression of Ccl2 is increased after tBHQ treatment as well. It seems that especially the oxidative agent tBHQ stimulates inflammation-associated mechanisms. The effects of genotoxic agents are mostly independent of WRN content. Therefore, the results indicate that WRN supports endothelial functionality especially under basal non genotoxic conditions and works against age-related mechanisms. The investigated BER-Factors (APE1, NEIL1, PARP1, OGG1) also maintain endothelial functionality with different efficiency.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Toxikologie
Dokument erstellt am:	09.04.2020
Dateien geändert am:	09.04.2020
Promotionsantrag am:	30.07.2019
Datum der Promotion:	11.02.2020