Dokument: Experimental studies concerning the unfolded protein response in glioma pathogenesis

Titel:	Experimental studies concerning the unfolded protein response in glioma pathogenesis
Weiterer Titel:	Experimentelle Studien über die unfolded protein response in der Gliomgenese
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=52771
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200409-113541-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M. Sc. Steltgens, Sascha [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,82 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.03.2020 / geändert 24.03.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Reifenberger, Guido [Gutachter] Prof. Dr. Aberle, Hermann [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Malignant gliomas are primary cancers of the central nervous system with often devastating consequences for the affected patients. Due to limited treatment options and lack of preventive or early diagnostic opportunities, gliomas are medically and scientifically challenging. The molecular processes in gliomagenesis are not yet fully understood. As initial changes mutations of the IDH1-gene were identified in diffuse astrocytic and oligodendroglial gliomas, which additionally acquire other mutations during tumorigenesis, in e.g. mutations in the genes TP53 and ATRX in astrocytic tumors, or CIC and TERT promotor mutations in oligodendroglial tumors. Further tumor growth stimulates angioneogenesis that is usually insufficient, thus resulting in low oxygen and glucose levels in the tumor tissue. These conditions influence protein folding and processing, thereby resulting in impaired proteostasis, e.g. in the endoplasmic reticulum (ER). Protostatic changes in the ER may activate the three membrane spanning receptors IRE1α, PERK, and ATF6 of the unfolded protein response (UPR). Activity of IRE1α results in unconventional splicing of the XBP1 mRNA and leading to a translation of the potent transcription factor XBP1, which in turn increases expression of proteins that restore proteostasis in the ER. Active PERK phosphorylates EIF2α and thereby reduces CAP-dependent translation, whereas ATF6 translocates to the Golgi membrane where it is cleaved. The cytosolic cleavage product is a potent transcription factor. In this thesis, concentrations of two ER stress-inducing drugs, namely Tunicamycin and Thapsigargin, were experimentally defined. This allowed for the molecular analysis of the UPR in mouse fibroblasts (NIH/3T3) and in a human glioma cell line (LN-308) at different time points by using high-throughput methods such as transcriptomics, translatomics, and proteomics. These experiments showed a similar UPR in both cell types, however, with distinct differences, e.g. in the consecutive expression of the major ER resident chaperone BIP as well as its quantitative changes upon UPR activity. In further experiments, the role of the tumorsuppressor protein p53 in the UPR was elucidated. These studies revealed that the activity of IRE1α in mouse neural stem and progenitor cells (NSC/NPCs) with Tp53 deletion was higher than in Tp53-wildtype cells. Changes in the expression level of the co-chaparone DNAJB9 could be identified as a possible link between p53 and IRE1α activity, as reported before by other groups. Additional own experiments showed that the oncometabolite 2-hydroxyglutarate that is produced by mutant IDH1 can activate the UPR in murine NSC/NPCs. This physiological endogenous proteostasis challenge renders these cells more resistant against external ER stressors. This observation supports the hypothesis that Idh1-mutant glioma precursor cells may be more resistant to ER stress induction during gliomagenesis when compared to wildtype NSC/NPCs. Further studies addressed to effects of the chemotherapeutic drug Bortezomib in six established glioblastoma cell lines. For this purpose, novel proteomic methods were developed in a collaborative project that revealed a different expression of UPR-related proteins in these cell lines. In summary, this thesis revealed novel molecular and functional insights regarding the role of the UPR in NIH/3T3 fibroblasts and in LN-308 glioma cells. In addition, possible links between glioma-associated gene mutations and the UPR were elucidated. Taken together, the own results highlight a pathogenetic relevance of the UPR in gliomas and lay the grounds for further analyses of the underlying pathomechanisms. Maligne Gliome stellen eine Tumorerkrankung des zentralen Nervensystems mit oftmals verheerenden Konsequenzen für die betroffenen Patienten dar. Kurative Behandlungsoptionen sind limitiert und eine frühzeitige Diagnose ist kaum möglich, was zu großen medizinischen und wissenschaftlichen Herausforderungen führt. Die molekularen Grundlagen der Gliomgenese sind noch nicht vollständig erforscht. Mutationen im IDH1-Gen wurden als eine der initialen Veränderungen in diffusen astrozytären Gliomen und oligodendroglialen Gliomen identifiziert zu der im Rahmen der Tumorprogression weitere genetische Veränderungen in anderen Genen, u.a. Mutationen der Gene TP53 und ATRX, oder Mutationen des Gens CIC und des TERT- Promoters in den oligodendroglialen Tumoren hinzukommen. Das schnelle Wachstum maligner Gliome stimuliert zwar die Angioneogenese, diese ist aber unzureichend, so dass die Tumorzellen in Gliomen mit einer niedrigen Sauerstoffverfügbarkeit und einer niedrigen Glukosekonzentration konfrontiert sind. Diese Umweltbedingungen können zu einer defekten Proteinfaltung und -prozessierung führen, die wiederum eine gestörte Proteostase im endoplasmatischen Retikulum (ER) bewirken. Veränderungen der Proteostase im ER führen zu einer Aktivierung der drei Transmembranrezeptoren IRE1α, PERK und ATF6, die als unfolded protein response (UPR)-Rezeptoren fungieren. Nach der Aktivierung von IRE1α kommt es zum veränderten Splicing der RNA des XBP1 Genes und Translation eines potenten Transkriptionsfaktors, der die Transkription von Genen fördert, welche die Proteostase wiederherstellen. Aktiviertes PERK phosphoryliert EIF2α und reduziert dadurch die CAP-abhängige Translation, während ATF6 in den Golgi-Apparat transloziert und dort zu einem aktiven Transkriptionsfaktor prozessiert wird. In dieser Arbeit wurden Behandlungskonzentrationen für die beiden ER-Stress-induzierenden Substanzen Tunicamycin und Thapsigargin experimentell definiert, die es ermöglichten, die UPR in murinen NIH/3T3 Fibroblasten und in humanen LN-308 Gliomzellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Behandlung mit Hilfe von Hochdurchsatz-Methoden im Rahmen eines Kooperationsprojektes zu untersuchen und Transkriptom-, Translatom- und Proteomanalysen durchzuführen. Bei der Analyse der verschiedenen Zeitpunkte nach Behandlung der Zellen zeigte sich, dass die UPR in den beiden untersuchten Zelllinien ähnlich ist, aber auch spezifische Unterschiede aufweist, wie zum Beispiel das konstitutive Expressionsniveau des wichtigsten ER-Chaperons BIP und dessen Veränderung nach Aktivierung des UPR-Signalwegs. Darüber hinaus wurde der Einfluss des Tumorsuppressorproteins p53 auf die UPR untersucht. Hierbei zeigte sich, dass die Aktivität von IRE1α in murinen neuralen Stamm- und Vorläuferzellen mit Tp53-Deletion im Vergleich zu entsprechenden Tp53-Wildtyp-Zellen höher ist. Diese Veränderung könnte durch eine veränderte Abundanz des Ko-Chaparones DNAJB9 bedingt sein, welches bereits von anderen Arbeitsgruppen für die Aktivitätsregulation von IRE1α verantwortlich gemacht wurde. In weiteren eigenen Experimenten ergab sich, dass der von mutiertem IDH1 generierte Onkometabolit 2-Hydroxyglutarat zu einer Aktivierung der UPR in neuralen Stamm- und Vorläuferzellen führt, welche diese resistenter gegenüber ER-Stress macht. Dies legt die Hypothese nahe, dass Idh1-mutierte, murine neurale Stamm- und Vorläuferzellen besser mit ER-Stress zurechtkommen, was letztendlich bei der Gliomentstehung von Bedeutung sein könnte. Darüber hinaus wurde untersucht wie sechs etablierte Gliomzelllinien auf das ER-stress- induzierende Chemotherapeutikum Bortezomib reagieren. Hierzu wurden in einem Kooperationsprojekt neue proteomische Methoden entwickelt, die zeigten, dass die sechs untersuchten Zelllinien eine differentielle Expression UPR- relevanter Proteine aufweisen. Insgesamt wurden in dieser Doktorarbeit molekulare und funktionelle Ergebnisse zur Rolle des UPR in NIH/3T3 Fibroblasten und LN-308 Gliomzellen erzielt. Zudem wurden mögliche Einflüsse Gliom- assoziierter Mutationen auf den UPR untersucht. Zusammengenommen sprechen die eigenen Befunde somit für eine pathogenetische Bedeutung des UPR in Gliomen und bilden den Ausgangspunkt für weitere Analysen der zugrundeliegenden molekularen Pathomechanismen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Neuropathologie
Dokument erstellt am:	09.04.2020
Dateien geändert am:	09.04.2020
Promotionsantrag am:	18.02.2020
Datum der Promotion:	13.03.2020