Dokument: Secondary Metabolites from Endophytic Fungi: Isolation, Structure Elucidation, Bioactivity and Expanding the Chemical Diversity

Titel:	Secondary Metabolites from Endophytic Fungi: Isolation, Structure Elucidation, Bioactivity and Expanding the Chemical Diversity
Weiterer Titel:	Sekundärmetaboliten aus endophytischen Pilzen: Isolierung, Strukturaufklärung, Bioaktivität und Erweiterung des Metabolitenmusters
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=52699
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200324-091316-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ariantari, Ni Putu [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 46,25 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.03.2020 / geändert 18.03.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Dr. h.c. Proksch, Peter [Gutachter] Prof. Dr. Kalscheuer, Rainer [Gutachter]
Stichwörter:	Endophytic fungi, secondary metabolites, expanding the chemical diversity, OSMAC approach
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Pilze leisten als Quelle von Naturstoffen einen erheblichen Beitrag zur Entdeckung von Arzneistoffen und Leitstrukturen. Insbesondere die als Endophyten bekannten Pilze, welche Pflanzengewebe besiedeln ohne innerhalb ihres Lebenzyklus am Wirt einen ersichtlichen Schaden zu verursachen, sind dafür bekannt eine Vielzahl strukturell neuartiger Naturstoffe zu produzieren, welche ein breites Spektrum biologischer Aktivitäten zeigen. Es wird angenommen, dass jede Pflanze Endophyten beherbergt, was die weite Verbreitung von Mikroorganismen in der Natur verdeutlicht. Unter Standard Laborbedingungen liegen bei den kultivierbaren Endophyten ein großteil der für die Sekundärmetabolitsynthese verantwortlichen Gencluster still. Dies zeigt, dass die Biosynthesemöglichkeiten in diesen Organismen deutlich größer sein müssen als aus den Veröffentlichungen der letzen Jahrzehnte hervorgeht. Da bisher nur ein Bruchteil dieser Organismengruppe untersucht wurde und das Biosynthesepotential größtenteils unerkannt blieb, sind Endophyten nach wie vor als vielversprechende Quelle strukturdiverser Molekülgerüste für die Entdeckung neuer Arzneistoffleitstrukturen anzusehen. Diese Dissertation stellt die Untersuchungen an den drei Endophyten Penicillium sp., Bulgaria inquinans und Didymella sp. vor, in deren Umfang es zur Isolation strukturdiverser Sekundärmetaboliten aus den Naturstoffklassen Indolditerpenoide, Azaphilone, Butyrolaktone und Decahydrofluorene kam. Einige dieser Metaboliten zeigten starke zytotoxische oder antibakterielle Aktivitäten. Außerdem wurden durch den Einsatz der OSMAC-Methode (One Strain Many Compounds) aus einem Kulturansatz von B. inquinans neue Metaboliten isoliert. Dieses Ergebnis verdeutlicht die Nützlichkeit der OSMAC-Methode beim Versuch Biosynthesewege zu aktivieren um die Strukturdiversität eines Produktionsstammes zu erhöhen. Die Struktur aller isolierten Naturstoffe wurde durch den Einsatz von Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und Massenspetrometrie (MS) aufgeklärt. Die absolute Konfiguration der neuen Verbindungen wurde durch den Einsatz von Röntgenbeugungskristallographie, Mosher Ester Analyse, Circulardichroismus Berechnungen (TDDFT-ECD) und Literaturdatenvergleich der spezifischen optischen Rotation bestimmt. Diese Dissertation ist in Kapitel gegliedert, welche die Ergebnisse der Projekte in Form von veröffentlichten oder eingereichten Manuskripten wiederspiegeln, aus denen die folgenden Zusammenfassungen als wörtliche Zitate übernommen wurden. Indolditerpenoide aus einem endophytischen Penicillium sp. Eine Untersuchung des chemischen Profils des Endophyten Penicillium sp. (Stamm ZO-R1-1), welcher aus der Wurzel der Arzneipflanze Zingiber officinale isoliert wurde, lieferte neun neue Indolditerpenoide (1−9) und dreizehn bekannte Verbindungen (10−22). Die Struktur der neuen Verbindungen wurde durch die Analyse ein- und zweidimensionaler NMR Spektren und Ergebnissen der hochauflösenden Massenspektrometrie (HRESIMS) aufgeklärt. Die absolute Konfiguration der neuen Naturstoffe 1, 3 und 7 wurde durch TDDFT-ECD Berechnungen bestimmt und durch die Kristallstrukturanalyse von 1 mittels anormaler Dispersion am Einzelkristall unabhängig bestätigt. Die isolierten Verbindungen wurden auf Zytotoxizität gegenüber den Zelllinien L5178Y, A2780, J82 und HEK-293 geprüft. Verbindung 1 war der am stärksten aktive Metabolit gegenüber L5178Y Zellen mit einem IC50 Wert von 3.6 μM und einem IC50 Wert von 8.7 μM gegenüber A2780 Zellen. Interessanterweise weist 1 ein neues diterpenoides Grundgerüst mit einem seltenen 6/5/6/6/6/6/5 verknüpftem heterozyklischen Ringsystem und einem aromatischen C-Ring auf. Dies scheint essentiell für die zytotoxische Aktivität dieses Naturstoffes gegenüber L5278Y und A2780 Zellen zu sein. Erweiterung der chemischen Diversität des endophytischen Pilzes Bulgaria inquinans, einem mistelassozierten Schlauchpilz, durch den Einsatz der OSMAC-Methode. Der endophytische Pilz Bulgaria inquinans (Isolat MSp3-1), isoliert aus einer Mistel (Viscum album), wurde auf festem Czapek Medium fermentiert. Die chromatographische Aufarbeitung des Ethylacetat Rohextraktes lieferte fünf neue Naturstoffe (1−5). Die anschließende Anwendung der OSMAC Strategie durch Zusatz verschiedener Salzmischungen (MgSO4, NaNO3 und NaCl) zum Czapek Medium induzierte die Akkumulation von neun zusätzlichen, neuen Sekundärmetaboliten (6−13, 16), von denen die meisten (8, 10−12) in Kulturen ohne Salzmischungen nicht detektierbar waren. Die Struktur der neuen Verbindungen wurde anhand ihrer 1D/2D-NMR Spektren und HRESIMS Daten bestimmt. Die TDDFT-ECD Berechnungen wurden benutzt um die absolute Konfiguration der neuen Verbindungen 1, 4 und 6 zu bestimmen und zusätzlich von Bulgarialakton B (14) für welches die absolute Konfiguration noch unbeschrieben war. Um die absolute Konfiguration von 12 und 13 erfolgreich zu bestimmen wurden modifizierte Mosher Ester Analysen durchgeführt. Die TDDFT-ECD Berechnungen ließen außerdem die bestimmung der absoluten Konfiguration von (+) Epicocconon zu, welches in seiner trizyklischen Substruktur das Enantiomer zu Bulgarialakton B (14) darstellt. Alle isolierten Metaboliten wurden auf ihre zytotoxische Aktivität untersucht. Verbindung 2 zeigte starke zytotoxische Aktivität gegenüber Mauslymphom Zelllinie L5178Y mit einem IC50 Wert von 1.8 μM, während sich die übrigen Verbindungen als inaktiv erwiesen. Didymellanosin, ein neues Decahydrofluorenanalogon, und Ascolakton C aus Didymella sp. IEA-3B.1, einem Endophyten aus Terminalia catappa. Didymellanosin (1), der erste Vertreter der Naturstoffklasse Decahydrofluorene, welcher ein 13-gliedriges makrozyklisches Alkaloidgrundgerüst besitzt, das mit Adenosin konjugiert ist und das neue Benzolaktonderivat Ascolakton C (4) wurden zusammen mit acht bekannten Verbindungen (2−3, 5−10) aus einer Reisfermentation des endophytischen Pilzes Didymella sp. IEA-3B-1, welcher mit der Wirtspflanze Terminalia catappa assoziiert ist, isoliert. Zusätzlich lies sich das neue Ascochitamin (11) isolieren, nachdem (NH4)2SO4 dem Reismedium zugesetzt wurde. Die Struktur der neuen Verbindungen wurde durch ausgiebige Analyse der ein- und zweidimensionalen NMR Daten und HRESIMS Daten ermittelt. Bei der Untersuchung der Zytotoxizität zeigte Didymellanosin (1) starke bis mäßige Aktivität gegenüber der murinen Lymphomzelllinie L5178Y, der Burkitt B-Lymphom Zelllinie (Ramos) und der T-Zell Leukämiezelllinie (Jurkat J16) mit IC50 Werten von jeweils 2.2, 7.6 und 11.0 μM. Außerdem wurde mit den Substanzen ein NFκB-Inhibitionsassay durchgeführt, bei dem Verbindung 1 und Phomapyrrolidon A (2) effizient die Aktivierung von NFκB blockierten. Bei der Untersuchung der antibakteriellen Aktivität stellte sich Ascomylaktam C (3) als aktivste Verbindung heraus. Beim Test gegen eine Auswahl grampositiver Bakterien, einschließlich therapieresistenter Stämme, wurden hierbei MIC zwischen 3.1 und 6.3 μM ermittelt, während 1 deutlich weniger aktiv war. Interessanterweise waren beide Verbindungen gegenüber dem gramnegativen Bakterium Acinetobacter baumannii aktiv, mit einer MIC von 3.1 μM, wenn zusätzlich 0.1 μM Colistin hinzugefügt wurden. Fungi are recognized as sources of many important drugs and lead structures. Particularly, endophytic fungi that colonize plant tissues without causing any harmful effects during their life cycle, are known as producers of numerous structurally novel natural products, possessing a wide range of bioactivities. Each plant is believed to harbor their own endophytes, which emphasizes the broad distribution of these microorganisms in nature. Among the culturable endophytes, many gene clusters responsible for the biosynthetic pathways of their metabolites are frequently silent under standard laboratory conditions, indicating their biosynthetic capacity to be far larger than previously reported. As only a small portion of these microorganisms has been investigated so far and their biosynthetic potential remains largely hidden, endophytes are considered as a promising source for diversifying scaffolds for the discovery of new drug leads. In this dissertation, the study on the three endophytes Penicillium sp., Bulgaria inquinans and Didymella sp. led to the isolation of several structurally diverse metabolites, including indole diterpenoids, azaphilones, butyrolactones and decahydrofluorene-class of natural products. Some of these metabolites showed potent cytotoxicity and antibacterial activities. Moreover, upon utilization of the “One Strain, MAny Compounds” (OSMAC) approach on the endophyte B. inquinans several new metabolites were obtained. This result highlights the usefulness of the OSMAC strategy for triggering particular biosynthetic pathways leading to structural diversity produced by this strain. The structures of the isolated natural products were elucidated by means of spectroscopic techniques (NMR and MS). The absolute configuration of the new compounds was established through the application of x-ray crystallography analysis, Mosher’s method and the TDDFT-ECD approach, as well as by comparison of their specific optical rotations to those reported in the literature. Accordingly, this dissertation reflects the result of the following three published or submitted manuscripts, from which the following abstracts are taken as direct quotations. Indole diterpenoids from an endophytic Penicillium sp. A chemical investigation of the endophyte Penicillium sp. (strain ZO-R1-1), isolated from roots of the medicinal plant Zingiber officinale, yielded nine new indole diterpenoids (1−9), together with 13 known congeners (10−22). The structures of the new compounds were elucidated by 1D and 2D NMR analysis in combination with HRESIMS data. The absolute configuration of the new natural products 1, 3 and 7 was determined using the TDDFT-ECD approach and confirmed for 1 by single-crystal x-ray determination through anomalous dispersion. The isolated compounds were tested for cytotoxicity against L5178Y, A2780, J82, and HEK-293 cell lines. Compound 1 was the most active metabolite towards L5178Y cells, with an IC50 value of 3.6 μM, and an IC50 against A2780 cells of 8.7 μM. Interestingly, 1 features a new type of indole diterpenoid scaffold with a rare 6/5/6/6/6/6/5 heterocyclic system bearing an aromatic ring C, which is suggested to be important for the cytotoxic activity of this natural product against L5278Y and A2780 cells. Expanding the chemical diversity of an endophytic fungus Bulgaria inquinans, an ascomycete associated with mistletoe, through an OSMAC approach. An endophytic fungus Bulgaria inquinans (isolate MSp3-1), isolated from mistletoe (Viscum album), was subjected to fermentation on solid Czapek medium. Chromatographic workup of the crude EtOAc extract yielded five new natural products (1–5). Subsequent application of the “One Strain, MAny Compounds” (OSMAC) strategy on this strain by the addition of a mixture of salts (MgSO4, NaNO3 and NaCl) to solid Czapek medium induced the accumulation of nine additional new secondary metabolites (6–13, 16), with most of them (8, 10–12) not detectable in cultures lacking the salt mixture. The structures of the new compounds were established on the basis of the 1D/2D NMR and HRESIMS data. The TDDFT-ECD method was applied to determine the absolute configurations of the new compounds 1, 4 and 6 as well as of the previously reported bulgarialactone B (14), for which the absolute configuration was unknown so far. The modified Mosher’s method was performed to assign the absolute configurations of 12 and 13. TDDFT-ECD analysis also allowed determining the absolute configuration of (+)-epicocconone, which had an enantiomeric absolute configuration in the tricyclic moiety compared to that of bulgarialactone B (14). All the isolated metabolites were evaluated for their cytotoxic activity. Compound 2 was found to possess strong cytotoxic activity against the murine lymphoma cell line L5178Y with an IC50 value of 1.8 μM, while the remaining metabolites were shown to be inactive. Didymellanosine, a new decahydrofluorene analogue, and ascolactone C from Didymella sp. IEA-3B.1 an endophyte of Terminalia catappa Didymellanosine (1), the first analogue of the decahydrofluorene-class of natural products bearing a 13-membered macrocyclic alkaloid conjugated with adenosine, and a new benzolactone derivative, ascolactone C (4) along with eight known compounds (2, 3, 5−10), were isolated from a solid rice fermentation of the endophytic fungus Didymella sp. IEA-3B.1 derived from the host plant Terminalia catappa. In addition, ascochitamine (11) was obtained when (NH4)2SO4 was added to rice medium and is reported here for the first time as a natural product. The structures of the new compounds were established through extensive analysis of one- and two-dimensional NMR data as well as HRESIMS data. Didymellanosine (1) displayed strong to moderate activity against the murine lymphoma cell line L5178Y, Burkitt’s lymphoma B cells (Ramos) and adult lymphoblastic leukemia T cells (Jurkat J16), with IC50 values of 2.2, 7.6 and 11.0 μM, respectively. Moreover, when subjected to a NFκB inhibition assay, compounds 1 and phomapyrrolidone A (2) efficiently blocked NFκB activation. In an antimicrobial assay, ascomylactam C (3) was the most active compound when tested against a panel of Gram-positive bacteria including drug-resistant strains with MICs of 3.1−6.3 μM, while 1 revealed weaker activity. Interestingly, both compounds were also found active against Gram-negative Acinetobacter baumannii with MICs of 3.1 μM, in the presence of a sublethal concentration (0.1 μM) of colistin.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Dokument erstellt am:	24.03.2020
Dateien geändert am:	24.03.2020
Promotionsantrag am:	19.12.2019
Datum der Promotion:	12.03.2020