Dokument: Kupfertransport und -koordinationschemie der kupferbindenden Domäne des Ethylenrezeptors ETR1
| Titel: | Kupfertransport und -koordinationschemie der kupferbindenden Domäne des Ethylenrezeptors ETR1 | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=52654 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20200324-111135-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Müller, Lena [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter] Prof. Dr. Gohlke, Holger [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Ethylenrezeptor ETR1, Ethylensignalweg, Kupferbindung, Kupfertransport, Proteininteraktion | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Das Pflanzenhormon Ethylen nimmt auf viele Prozesse in Pflanzen Einfluss.
Dazu zählen unter anderem die Fruchtreifung und die Seneszenz. Ein Ethylensignal wird in Arabidopsis thaliana von fünf ER-membranständigen Rezeptorkinasen, zu denen auch ethylene response 1 (ETR1) zählt, wahrgenommen und bis in den Zellkern weitergeleitet. Dort kann dann eine Ethylenantwort ausgelöst werden. Die Ethylenwahrnehmung und die Aktivität der Ethylenrezeptoren ist dabei maßgeblich von einem Kupfer(I)-Kofaktor, der in die Transmembrandomäne integriert werden muss, abhängig. Die Untersuchung des Kupfer(I)-Kofaktors und dessen Bindung an ETR1 steht im Focus dieser Arbeit. Dazu wurden die Kupferbindungsaffinität und die Kupfer-Protein-Stöchiometrie bestimmt und der Kupfertransfer auf die Sensordomäne des Rezeptors ETR1 analysiert. Ein weiterer Aspekt dieser Arbeit befasst sich mit der Validierung eines mittels ab initio Strukturvorhersagen und koevolutionären Informationen generierten Strukturmodells der Transmembrandomäne von ETR1. Dazu wurden Rezeptorvarianten von ETR1 in E. coli heterolog exprimiert und anschließend mittels Metallionen-Affinitätschromatographie isoliert. Um die isolierten Proteine weiterführend auf ihre Faltung und Funktionalität zu überprüfen, wurden CD-Spektren aufgezeichnet, Interaktionsstudien mittels Microscale Thermophorese durchgeführt und die Kupferbindung untersucht. Die Untersuchung der Kupferbindung an die rekombinanten Proteine liefert Hinweise dafür, dass neben dem bereits bekannten Kupfer(I)-Kofaktor ebenfalls Kupfer(II)-Ionen an die Transmembrandomäne von ETR1 binden. Der Transfer von Kupfer(I)-Ionen auf die Transmembrandomäne von ETR1 konnte mit Hilfe der pflanzlichen, kupferbeladenen Chaperone CCH und ATX1 sowie der N-Terminus der P-Typ ATPase RAN1 nachgewiesen werden. Gleichzeitig bleibt der Kupfertransfer aus, wenn eine Rezeptorvariante von ETR1 verwendet wird, die durch Mutation der Reste C65 und H69 keine Ethylenbindungsaktivität mehr besitzt. Ebenfalls ist kein Kupfertransfer zu beobachten, wenn ein für das humane ATX1-Homolog beschriebener Inhibitor DC_AC50 verwendet wird.The plant hormone ethylene is involved in many plant developmental processes such as fruit ripening or senescence. In Arabidopsis thaliana the ethylene signal is perceived by a small family of ER bound membrane receptor kinases. One of these receptors is named ethylene response 1 (ETR1). The perceived ethylene signal is transferred into the nucleus where it triggers the ethylene responses. Ethylene perception and receptor activity critically depend on a copper(I) cofactor integrated into the transmembrane domain of the ethylene receptors. The focus of this work is the analysis of the copper(I) cofactor and its binding to ethylene receptor ETR1. To this end the copper binding affinity and copper-protein stoichiometry as well as the copper transfer of the transmembrane domain of ETR1 was investigated. In addition, the validation of the first structural model of the transmembrane domain of ETR1 is presented here. It was generated by combining ab initio structure predictions and coevolutionary information. Ethylene receptor variants of ETR1 were heterologous expressed in E. coli and isolated from the bacterial host by metal ion affinity chromatography. Folding and functionality of receptor variants were analysed by CD spectroscopy, protein-protein interaction studies by microscale thermophoresis and copper binding studies. These studies suggest copper(II) binding of ETR1 in addition to copper(I) binding. The transfer of copper(I) to the transmembrane domain of ETR1 was demonstrated by using copper loaded plant chaperons CCH and ATX1 as well as the N-terminal part of the P-type ATPase RAN1. No copper transfer was observed when a receptor variant with mutations at the positions C65 and H69 was used. Also, no copper transfer occurred when copper loaded chaperons were incubated with DC_AC50 which was shown to inhibit the copper transfer of the humane chaperon homolog to its target protein. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 24.03.2020 | |||||||
| Dateien geändert am: | 24.03.2020 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 26.11.2019 | |||||||
| Datum der Promotion: | 30.01.2020 |
