Dokument: Untersuchung der Zellstrukturen, die die autophagiebezogenen Proteine GABARAP und LC3B enthalten, mittels Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie

Titel:	Untersuchung der Zellstrukturen, die die autophagiebezogenen Proteine GABARAP und LC3B enthalten, mittels Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie
Weiterer Titel:	Investigation of the cellular structures containing the autophagy-related proteins GABARAP and LC3B by single molecule localization microscopy
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=52499
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200313-094848-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Abdollahzadeh, Iman [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 11,92 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.03.2020 / geändert 03.03.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Fahlke, Christoph [Gutachter]
Stichwörter:	Atg8; EYFP; Dendra2; GABARAP; LC3B; SMLM; autophagy; shape distribution; single molecule localisation microscopy; super-resolution
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Untersuchung von GABARAP- und LC3B-Proteinen aus der Atg8-Proteinfamilie von Säugetieren zeigte, dass die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie (SMLM) für die Autophagieforschung gut geeignet ist und neue Erkenntnisse über die Größen- und Formverteilung von Vesikelstrukturen im Bereich von 50 nm bis bis zu mehreren µm liefert. GABARAP- und LC3B-Proteine wurden an EYFP- und Dendra2-Fluoreszenzproteine (FPs) fusioniert und in HEK-293-Zelllinien transient oder stabil überexprimiert. Zunächst wurde die SMLM-Bildgebung von EYFP-markierten Proteinen optimiert, indem die SMLM-Leistung von EYFP in Abhängigkeit von der Anregungswellenlänge untersucht wurde. Die Anregung von EYFP-Molekülen bei 514 nm erwies sich als ideal, da man im Vergleich zur üblicherweise verwendeten Anregung bei 488 nm mehr Einzelmolekül-Emissionsereignisse mit längerer Dauer und höherem Signal-Rausch-Verhältnis detektiert. Zusätzlich wurde eine zweifarbige SMLM-Bildgebung mit einem Paar von FPs, die üblicherweise in der Fluoreszenzbildgebung von lebenden Zellen verwendet werden (EYFP und mCherry), unter Verwendung eines neuen Bildgebungspuffers etabliert, der die Photokonversion von mCherry-Molekülen unterstützt, ohne die Einzelmolekülbildgebung mit Hilfe von EYFP-Molekülen wesentlich zu beeinflussen. Die überwiegende Mehrheit der FP-GABARAP- und FP-LC3B-haltigen zytoplasmatischen Strukturen, die mit SMLM nachgewiesen wurden, weisen Größen auf, die deutlich unter der beugungsbegrenzten Auflösung liegen. Es wurde festgestellt, dass die Größenverteilungen für FP-GABARAP und FP-LC3B sehr ähnlich waren, unabhängig vom FP-Typ oder Zustand der Zellen (ruhend oder autophagieinduziert). Durch Formbestimmung konnte jedoch nachgewiesen werden, dass FP-LC3B-Moleküle überwiegend in asymmetrischen Strukturen lokalisiert sind (elliptisch oder U-förmig in der 2D-Projektion), während FP-GABARAP-Moleküle meist Teil von Strukturen mit kreisförmigem Profil sind. FP-GABARAP und FP-LC3B befinden sich daher zu einem großen Teil in unterschiedlichen zytoplasmatischen vesikulären Strukturen, die für die Autophagie relevant sind. Die konventionelle Fluoreszenzbildgebung findet nur die größten und hellsten FP-GABARAP- und FP-LC3B-haltigen Strukturen. Es wurde gezeigt, dass die Formklassifizierung von zytoplasmatischen Strukturen in konventionellen Fluoreszenzbildern in > 50% der Fälle die falsche Kategorie bestimmt, wie anhand der entsprechenden SMLM-Bilder beurteilt wurde. Schließlich haben wir bei der Analyse der zweifarbigen SMLM-Bilder mit EYFP-GABARAP oder EYFP-LC3B einerseits und mCherry-LAMP1 andererseits gezeigt, dass EYFP-GABARAP im Vergleich zu EYFP-LC3B einen höheren Grad an Kolokalisierung mit späten Endosom / Lysosom-Strukturen zu haben scheint. The study of GABARAP and LC3B proteins from the mammalian Atg8 protein family showed that single molecule localization microscopy (SMLM) is well suited to be used in autophagy research and provides new insight by size and shape determination of vesicular structures in the range of 50 nm to several µm. GABARAP and LC3B proteins were fused to EYFP and Dendra2 fluorescent proteins (FPs) and transiently or stably overexpressed in HEK-293 cell lines. First, SMLM imaging of EYFP-labelled proteins was optimized by elucidating the SMLM performance of EYFP dependent on the excitation wavelength. Excitation of EYFP molecules at 514 nm was found to be ideal since one detects more single molecule emission events with longer duration and higher signal-to-noise ratio when compared to the commonly used excitation at 488 nm. In addition, two-colour SMLM imaging with a pair of FPs commonly used in live cell fluorescence imaging (EYFP and mCherry) was established with the use of a new imaging buffer supporting the photoconversion of mCherry molecules without any negative effect on the single molecule imaging of EYFP molecules. The vast majority of FP-GABARAP and FP-LC3B containing cytoplasmic structures detected with SMLM have sizes well below the diffraction limited resolution. It was found that size distributions were very similar for FP-GABARAP and FP-LC3B, independent of FP type or state of the cells (resting or autophagy-induced). It was proven, however, through shape determination that FP-LC3B molecules are dominantly located in asymmetric structures (elliptic or U-shaped in the 2D projection), while FP-GABARAP molecules are mostly part of structures with circular profile. FP-GABARAP and FP-LC3B, therefore, are located to a large extent to different cytoplasmic vesicular structures. This is a clear indication that GABARAP and LC3B play different roles in autopagosome biogenesis, which holds true if the overexpressed FP-GABARAP and FP-LC3B proteins mainly localize to autophagic structures. Conventional fluorescence imaging detects only the largest and brightest FP-GABARAP and FP-LC3B containing structures. Very importantly, it was demonstrated that the shape classification of cytoplasmic structures in conventional fluorescence images determines the wrong category in > 50% of cases, as judged by the corresponding SMLM images. Finally, with the analysis of the two-colour SMLM images featuring EYFP-GABARAP or EYFP-LC3B on the one hand and mCherry-LAMP1 on the other, it was shown that EYFP-GABARAP appears to have a higher degree of co-localization with late endosome/lysosome structures compared with EYFP-LC3B.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	13.03.2020
Dateien geändert am:	13.03.2020
Promotionsantrag am:	09.01.2020
Datum der Promotion:	27.02.2020