Dokument: Functional role of the Synaptic Adhesion Molecule N-cadherin in Synaptic Vesicle Exo- and Endocytosis

Titel:	Functional role of the Synaptic Adhesion Molecule N-cadherin in Synaptic Vesicle Exo- and Endocytosis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=52373
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20210518-131944-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Dagar, Sushma [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,02 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.04.2020 / geändert 10.04.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Gottmann, Kurt [Gutachter] Prof. Dr. Aberle, Hermann [Gutachter]
Stichwörter:	N-cadherin, Synaptic vesicle exocytosis, endocytosis
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Neurotransmission at chemical synapses is initiated by fusion of neurotransmitter filled synaptic vesicles to the presynaptic membrane. This fusion process called exocytosis is followed subsequently by vesicle endocytosis. The compensatory endocytosis of the synaptic vesicle membrane newly added to the presynaptic plasma membrane during exocytosis is necessary for maintaining the size and proper functioning of synapses. N-cadherin, a Ca2+ dependent homophilic cell adhesion protein, is well known to play an important postsynaptic role in long-term-potentiation and spine stabilization. It has also been described to influence presynaptic function at mammalian CNS synapses. However, the specific roles of N-cadherin in presynaptic vesicle exo- and endocytosis remain to be clarified. In this work, the functional role of N-cadherin at cortical synapses was examined, with a keen focus on synaptic vesicle endocytosis. To understand the role of N-cadherin in synaptic vesicle cycling at cortical synapses, synaptophysin-pHluorin (SypHy) fluorescence imaging was performed in cultured mouse cortical neurons during and directly following extracellular stimulations. Ncadherin expression and function were manipulated by either a Cre mediated conditional knockout approach or by overexpression of a mutant N-cadherin protein lacking the extracellular domains (Ncad∆E). SypHy imaging results in N-cadherin knockout neurons at room temperature showed no significant changes in vesicle exo- and endocytosis. However, synaptic vesicle endocytosis is known to be highly temperature-sensitive. Therefore, I repeated the SypHy experiments in N-cadherin knockout neurons at physiological temperature, which resulted in significantly reduced vesicle endocytosis. However, vesicle exocytosis seemed not to be affected by N-cadherin knockout. We reasoned that N-cadherin knockout might reduce the availability of readily releasable vesicles in response to single action potentials, but the stimulation paradigm used in our experimental setup might be too long-lasting and due to short-term plasticity phenomena might result in a similar total number of vesicles released. To test this hypothesis, the effect of N-cadherin knockout on exocytosis was additionally studied using a stimulation protocol with less action potentials and indeed, vesicle exocytosis was now found to be reduced. To further investigate a potential specific role of N-cadherin in different modes of vesicle endocytosis, N-cadherin knockout cortical neurons were co-stained with FM1-43 to stain all endocytosed vesicles and with tetramethylrhodamine–dextran (TMR-dextran, 40 kDa) to stain vesicles endocytosed via bulk endocytosis. Different stimulations paradigms were used to activate the different modes of endocytosis. N-cadherin knockout neurons showed a significant reduction in clathrin-mediated endocytosis of individual vesicles. Most interestingly, FM1-43 stained puncta colocalizing with TMR-dextran were also reduced in N-cadherin knockout neurons indicating also impaired bulk endocytosis. As a first step in investigating the molecular mechanisms of regulation of endocytosis by N-cadherin, the role of actin was tested. Jasplakinolide, an actin polymerizing drug, rescued vesicle endocytosis defects in N-cadherin knockout neurons suggesting that N-cadherin regulates endocytosis via actin. During strong vesicle release, clathrin-mediated endocytosis is too slow to compensate for the newly added presynaptic vesicle membrane. Therefore to maintain the structural and functional integrity of the synapses, neurons need an additional mode of endocytosis, and they are suggested to undergo vesicle membrane retrieval via large invaginations in the form of bulk endosomes at the peri-active zone. Since Ncadherin is also located at the peri-active zone, a role of N-cadherin in regulating bulk endocytosis was proposed. To address this hypothesis, structured illumination microscopy (SIM) imaging was performed during strong synaptic vesicle release. SIM imaging was done on immunocytochemically stained synapses and N-cadherin clusters were quantitatively analysed for their spatial relation to pre- (VGLUT1) and postsynaptic (PSD95) sites. SIM imaging results suggested that during strong vesicle release N-cadherin is recruited to the peri-active zone of the synapses largely devoid of N-cadherin prior to stimulation. These findings indicate that synapses may need additional N-cadherin during strong synaptic vesicle release to undergo efficient compensatory bulk endocytosis. This work also investigated the influence of N-cadherin on the functioning of other synaptic cell adhesion molecules (SCAMs) like Neuroligin1 and LRRTM2. Neuroligin1 and LRRTM2 were compared for their synaptogenic activity using an overexpression approach during the differentiation of mouse cortical neurons in vitro. The presynaptic vesicle cluster inducing effect of overexpressed Neuroligin1 and LRRTM2 was quantified by immunostaining VAMP2 positive puncta in the contacting axon. The vesicle cluster inducing activity of Neuroligin1 was developmentally downregulated, while LRRTM2 was found to exhibit synaptogenic activity in both immature and mature neurons. The N-cadherin dependence of the vesicle cluster inducing activities was examined by Cre mediated conditional knockout of Ncadherin from postsynaptic sites. Intriguingly, the synaptogenic effect of Neuroligin1 was found to be dependent on N-cadherin expression in immature neurons. In contrast, LRRTM2’s synaptogenic effect was independent of N-cadherin expression both in immature and mature neurons. In summary, the major finding of this work is that N-cadherin plays important regulatory roles in both vesicle exocytosis and endocytosis at central synapses under physiological temperature conditions. Die Neurotransmission an chemischen Synapsen wird durch Fusion von mit Neurotransmittern gefüllten synaptischen Vesikeln mit der präsynaptischen Membran initiiert. Diesem als Exozytose bezeichneten Fusionsprozess folgt eine Vesikelendozytose. Die kompensatorische Endozytose der synaptischen Vesikelmembran, die der präsynaptischen Plasmamembran während der Exozytose neu hinzugefügt wurde, ist erforderlich, um die Größe und Funktion der Synapsen aufrechtzuerhalten. N-Cadherin, ein Ca2+-abhängiges homophiles Zelladhäsionsprotein spielt bekanntermaßen eine wichtige postsynaptische Rolle bei der langfristigen Potenzierung und Stabilisierung der Synapsen. Es wird auch vermutet, dass es die präsynaptische Funktion an ZNS-Synapsen von Säugetieren beeinflusst. Die spezifischen Funktionen von N-Cadherin bei der präsynaptischen Vesikel Exo- und Endozytose müssen jedoch noch geklärt werden. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Rolle von N-Cadherin an kortikalen Synapsen untersucht, wobei der Schwerpunkt auf der Endozytose synaptischer Vesikel lag. Um die Rolle von N-Cadherin beim Zyklus der synaptischen Vesikel an kortikalen Synapsen zu verstehen, wurde die Fluoreszenzbildgebung von Synaptophysin-pHluorin (SypHy) in kultivierten kortikalen Mausneuronen während, und direkt nach, extrazellulären Stimulationen durchgeführt. Expression und Funktion von N-Cadherin wurden entweder durch einen Cre-vermittelten konditionalen Knockout-Ansatz oder durch Überexpression eines mutierten N-Cadherin-Proteins ohne die extrazellulären Domänen (Ncad∆E) manipuliert. Die Ergebnisse der SypHy-Bildgebung in N-Cadherin-Knockout-Neuronen bei Raumtemperatur zeigten keine signifikanten Veränderungen der Vesikel-Exo- und -Endozytose. Es ist jedoch bekannt, dass die Endozytose der synaptischen Vesikel sehr temperaturempfindlich ist. Daher wiederholte ich die SypHy-Experimente in N-Cadherin-Knockout-Neuronen bei physiologischer Temperatur, was zu einer signifikant verringerten Vesikelendozytose führte. Die Vesikelexozytose schien jedoch nicht durch N-Cadherin-Knockout beeinträchtigt zu werden. Ich stellte die Hypothese auf, dass ein N-Cadherin-Knockout die Verfügbarkeit leicht freisetzbarer Vesikel als Reaktion auf einzelne Aktionspotentiale verringern könnte, das in meinem Versuchsaufbau verwendete Stimulationsparadigma jedoch möglicherweise zu langanhaltend ist und aufgrund von kurzfristigen Plastizitätsphänomenen zu einer ähnlichen Gesamtzahl der freigesetzten Vesikel führen könnte. Um diese Hypothese zu testen, wurde der Effekt von N-Cadherin-Knockout auf die Exozytose zusätzlich unter Verwendung eines Stimulationsprotokolls mit weniger Aktionspotentialen untersucht, und tatsächlich wurde nun eine Verringerung der Vesikelexozytose registriert. Um eine mögliche spezifische Rolle von N-Cadherin bei verschiedenen Arten der Vesikelendozytose weiter zu untersuchen, wurden die kortikalen N-Cadherin-Knockout-Neuronen mit FM1-43 angefärbt, um alle endozytierten Vesikel darzustellen und simultan mit Tetramethylrhodamin-Dextran (TMR-Dextran, 40 kDa) zur Färbung von Vesikeln, die über Bulk-Endozytose endozytiert wurden. Verschiedene Stimulationsparadigmen wurden verwendet, um die verschiedenen Arten der Endozytose zu aktivieren. N-Cadherin-Knockout-Neuronen zeigten eine signifikante Reduktion der Clathrin-vermittelten Endozytose einzelner Vesikel. Am interessantesten ist, dass FM1-43-gefärbte Synapsen, die gleichzeitig mit TMR-Dextran langefärbt waren, auch bei N-Cadherin-Knockout-Neuronen reduziert waren, was auf eine beeinträchtigte Bulk-Endocytose hinweist. Als ersten Schritt zur Untersuchung der molekularen Mechanismen der Regulation der Endozytose durch N-Cadherin wurde die Rolle von Aktin getestet. Jasplakinolid, eine aktinpolymerisierende Substanz, verbesserte Vesikelendozytosedefekte in N-Cadherin-Knockout-Neuronen, was darauf hindeutet, dass N-Cadherin die Endozytose über Aktin reguliert. Während einer starken Vesikelfreisetzung ist die Clathrin-vermittelte Endozytose zu langsam, um die neu hinzugefügte präsynaptische Vesikelmembran zu kompensieren. Um die strukturelle und funktionelle Integrität der Synapsen aufrechtzuerhalten benötigen Neuronen einen zusätzlichen Endozytosemodus, und es wird vorgeschlagen, dass sie über große Invaginationen in Form von Bulk-Endosomen an der periaktiven Zone erfolgt. Da sich N-Cadherin auch in der periaktiven Zone befindet, wurde eine Rolle von N-Cadherin bei der Regulierung der Bulk-Endozytose vermutet. Um diese Hypothese zu belegen, wurde während der Freisetzung synaptischer Vesikel eine strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) durchgeführt. Die SIM-Bildgebung wurde an immunzytochemisch gefärbten Synapsen durchgeführt, und die N-Cadherin-Cluster wurden quantitativ auf ihre räumliche Beziehung zu prä- (VGLUT1) und postsynaptischen (PSD95) Stellen analysiert. Die Ergebnisse der SIM-Bildgebung deuteten darauf hin, dass während einer starken Vesikelfreisetzung N-Cadherin in die periaktive Zone der Synapsen rekrutiert wird, die vor der Stimulation weitgehend frei von N-Cadherin ist. Diese Befunde deuten darauf hin, dass Synapsen während einer starken Freisetzung synaptischer Vesikel möglicherweise zusätzliches N-Cadherin benötigen, um eine effiziente kompensatorische Bulk-Endozytose durchzuführen. Diese Arbeit untersuchte auch den Einfluss von N-Cadherin auf die Funktion anderer synaptischer Zelladhäsionsmoleküle (SCAMs) wie Neuroligin1 und LRRTM2. Neuroligin1 und LRRTM2 wurden hinsichtlich ihrer synaptogenen Aktivität unter Verwendung eines Überexpressionsansatzes während der Differenzierung von kortikalen Mausneuronen in vitro verglichen. Der präsynaptische Vesikelcluster induzierende Effekt von überexprimiertem Neuroligin1 und LRRTM2 wurde durch Immunfärbung von VAMP2-positiven Puncta im kontaktierenden Axon quantifiziert. Die Vesikelcluster-induzierende Aktivität von Neuroligin1 wurde in der Entwicklung herunterreguliert, während LRRTM2 sowohl in unreifen als auch in reifen Neuronen synaptogene Aktivität zeigte. Die N-Cadherin-Abhängigkeit der Vesikelclusterinduzierenden Aktivitäten wurde durch einen Cre-vermittelten konditionalen Knockout von N-Cadherin an postsynaptischen Stellen untersucht. Interessanterweise zeigte sich, dass die synaptogene Wirkung von Neuroligin1 in unreifen Neuronen von der N-Cadherin-Expression abhängt. Im Gegensatz dazu war die synaptogene Wirkung von LRRTM2 sowohl in unreifen als auch in reifen Neuronen unabhängig von der N-Cadherin-Expression. Zusammenfassend ist das wichtigste Ergebnis dieser Arbeit, dass N-Cadherin sowohl bei der Vesikelexozytose als auch bei der Endozytose an zentralen Synapsen unter physiologischen Temperaturbedingungen eine wichtige regulatorische Rolle spielt.
Rechtliche Vermerke:	Sperrvermerk vom 14.04.2020 bis 13.04.2021
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Neuro- und Sinnesphysiologie
Dokument erstellt am:	18.05.2021
Dateien geändert am:	18.05.2021
Promotionsantrag am:	22.10.2019
Datum der Promotion:	29.01.2020