Dokument: Analyse der dynamischen mGBP-Rekrutierung zu Pathogen-enthaltenden Membrankompartimenten
| Titel: | Analyse der dynamischen mGBP-Rekrutierung zu Pathogen-enthaltenden Membrankompartimenten | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=52328 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20200226-150458-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Steffens, Nora [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Pfeffer, Klaus [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Toxoplasma gondii, mGBP | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Krankheit Toxoplasmose resultiert aus einer Infektion mit dem obligat-intrazellulären Protozoon Toxoplasma gondii (T. gondii). Insbesondere immunsupprimierte Personen und Frauen mit einer erstmaligen Infektion während einer Schwangerschaft gelten als gefährdet und können schwerwiegende Krankheitsbilder bedingt durch eine Toxoplasmeninfektion ausbilden. Die transplazentare Übertragung von T. gondii führt in vielen Fällen zu Missbildungen des Fötus, sowie zu Fehl- und Totgeburten. In Mausmodellen und in vitro Experimenten mit einer fehlenden Interferon-ɣ (IFNɣ) Produktion wurden ebenfalls Defekte bei einer effektiven Immunabwehr gegen T. gondii detektiert. Im Zuge der Invasion in Wirtszellen bildet der Parasit ein spezifisches subzelluläres Membrankompartiment aus, die parasitophore Vakuole (PV). Die PV dient als wichtiger Schutzmechanismus für die parasitäre Replikation innerhalb der Wirtszelle und den Stadienwechsel von den akut infektiösen Tachyzoiten zu den chronisch persistierenden Bradyzoiten.
Das Zytokin IFNɣ beeinflusst die Stimulation hunderter Gene mit wichtigen Funktionen in der Immunabwehr, unter anderem gegen T. gondii. Die murinen Guanylat-bindenden Proteine (mGBPs) sind IFNɣ induzierbare Dynamin-ähnliche GTPasen, welche in den meisten Zelltypen exprimiert werden und eine wichtige Rolle bei der intrazellulären Kontrolle der Parasiten Replikation einnehmen. Mitglieder der mGBPs, insbesondere mGBP2 und mGBP7, assemblieren an die zytoplasmatische Seite der T. gondii-PV und interagieren mit Membrankomponenten durch einen noch uncharakterisierten Mechanismus. In dieser Forschungsarbeit wurde die Interaktion des mGBP7-Proteins mit T. gondii Parasiten untersucht. Es wurde beobachtet, dass mGBP7 direkt an die PV-Membran (PVM) und nach einer Ruptur der PVM auch direkt an der Parasiten-Plasmamembran akkumulieren kann. Elektronenmikroskopisch konnten in Bereichen, in denen mGBP7 lokalisiert, tubuläre Proteinstrukturen nachgewiesen werden, deren Identität jedoch noch nicht final geklärt wurde und weitere Untersuchungen erforderlich machen. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass mGBP7 mit weiteren mGBP-Proteinen im Zytoplasma und an der PV kolokalisieren kann. mGBP7 zeigte Kolokalisation mit mGBP6 an der PV-Membran und zu einem hohen Maß mit mGBP3, sowohl im Zytosol als auch direkt an dem Parasiten. Dabei bestand keine gegenseitige Beeinflussung der mGBPs in Bezug auf die Rekrutierungsfähigkeit zum Parasiten, da die Rekrutierung von mGBP3 und mGBP6 auch in mGBP7-/- MEF-Zellen erfolgte. Zwischen mGBP7 und mGBP2 bestand keine Kolokalisation, doch hat mGBP2 einen deutlichen Effekt auf die mGBP7-Rekrutierung an die PV. Es konnte eine Rekrutierungs Hierarchie postuliert werden, bei der mGBP2 eine primäre Rekrutierung nach einer T. gondii Infektion zukommt. mGBP7 wird nachfolgend an die PV des Parasiten assoziiert. Die direkte Protein-Lipid-Interaktion an der T. gondii-PV oder an der Plasmamembran galt stets als schwierig aufzuklären, da eine hochreine PV Isolation bisher nicht möglich war. Zur Umgehung dieses Problems wurden Membrane Lipid Strips und die GUV-Technologie (giant unilamellar vesicles) eingesetzt. Dabei wurden signifikante Affinitäten und eine direkte Bindung von mGBP2- und mGBP7 Proteine an die Lipide Phosphatidsäure (PA) und Cardiolipin (CL) nachgewiesen. Mutations- und Trunkationsanalysen an mGBP7 lieferten Hinweise darauf, dass die Akkumulation von mGBP7 an PA auf elektrostatische Verbindungen und positiv geladenen Aminosäuren basieren könnte. Die Bindung von mGBP7 an CL ist vermutlich auf hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen zurückzuführen. Zudem ist für mGBP2 bekannt, dass ein C-terminales Isoprenylierungsmotiv (CaaX) die Membranbindung fördert und verankert. Das mGBP7 Protein weist diese CaaX-Box nicht auf, dennoch konnte eine ähnliche Funktion für die C terminalen 49 Aminosäuren festgestellt werden. Bei einer Deletion dieser Aminosäuren verringerte sich die Akkumulation von mGBP7 an der T. gondii-PV auf ein Minimum. Die Detektion von CL und PA als interagierende Lipide für mGBP2 und mGBP7, sowie die spezifischen Bindungseigenschaften der Proteine, können zu der Entwicklung neuer Behandlungsmethoden gegen T. gondii beitragen.Toxoplasmosis is a disease that results from infection with the obligate intracellular protozoan parasite Toxoplasma gondii (T. gondii). Patients with immunodeficiencies and pregnant women with a first-time T. gondii-infection show serious disease. The transplacental transmission of T. gondii can lead to malformations of the unborn child but most of the time it ends in miscarriages or stillbirths. Mouse models and in vitro experiments with a defective interferon-ɣ (IFNɣ) production demonstrate serious deficiencies in effective immune responses against T. gondii. After invasion of target cells, T. gondii creates a specific membranous subcellular compartment, the parasitophorous vacuole (PV). The PV acts like a defense wall against the immune system and enables the parasite’s replication and the differentiation of the acute infectious tachyzoites into chronically persisting bradyzoites. IFNɣ is a major cytokine that mediates the stimulation of hundreds of genes that play important roles in the immune defense against T. gondii and other pathogens. The murine guanylate binding proteins (mGBPs) are IFNɣ inducible dynamin-like GTPases which are expressed in most cell types and show a crucial function for the control of intracellular parasite replication. Members of the mGBP family, in particular mGBP2 and mGBP7, assemble at the cytoplasmic side of the PV and interact with membrane compartments via yet uncharacterized mechanisms. This research thesis aimed at studying the molecular mechanisms by which mGBP7 impairs the vital functions of T. gondii by accumulating directly at the PV membrane and, after its disruption, also at the parasite’s plasma membrane. This effect subsequently leads to the parasite’s death by an unknown mechanism. Via electron microscopy it was shown that tubular protein structures can be found in areas where mGBP7 is localized. However, the identity of these structures has yet to be finally elucidated and requires further investigation. Additionally, mGBP7 colocalizes with further members of the mGBP family. mGBP7 colocalized with mGBP6 at the T. gondii-PV as well as with mGBP3 in the cytosol and at the parasite’s membranes. No mutual interference in recruitment towards the T. gondii PV could be shown for these pairs of mGBPs since the accumulation of mGBP3 and mGBP6 in mGBP7-/- cells appeared undisturbed. Thus, the implications of these colocalizations need to be further analyzed. The case is different for the interaction between mGBP2 and mGBP7. No colocalization could be observed for these proteins, although a clear influence of mGBP2 on mGBP7 was determined. Thus, a hierarchy of recruitment towards the parasite could be postulated for mGBP2 and mGBP7, where mGBP2 represents the primary association at the T. gondii PV, followed by a secondary accumulation by mGBP7. Within this investigation, it became obvious that the absence of mGBP2 led to a significant defect on the mGBP7 accumulation at T. gondii. In the past, direct protein-lipid-interactions at the T. gondii-PV or plasma membrane have been difficult to analyze because of the highly pure isolation of the parasite’s membranes has not been possible up to now. To circumvent this problem, Membrane Lipid Strips and the GUV-technology (giant unilamellar vesicles) were used. Here, it was possible to detect significant ans specific binding affinities of mGBP2 and mGBP7 to the membrane lipids phosphatidic acid (PA) and cardiolipin (CL). Mutational and truncation analyses of mGBP7 suggested that interactions of mGBP7 with PA may be based on electrostatic interactions and positive charged amino acids. The binding of mGBP7 to CL is likely based on hydrophobic and electrostatic interactions. Additionally, mGBP2 contains a C-terminal isoprenylation motif (CaaX) that enables membrane binding effects. In contrast, mGBP7 does not contain an isoprenylation motif. However, the C-terminal 49 amino acids were demonstrated to perform a similar function. The deletion of these amino acids resulted in a nearly complete ablation of T. gondii targeting by mGBP7. The detection of CL and PA as interacting lipids of the mGBP2 and mGBP7 proteins plus their specific binding properties might contribute to the understanding of Toxoplasmosis and to the development of new treatment opportunities in the long term. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 26.02.2020 | |||||||
| Dateien geändert am: | 26.02.2020 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 07.01.2020 | |||||||
| Datum der Promotion: | 12.02.2020 |
