Dokument: Precision Glycomacromolecules with Hydrophobic Main Chain Motives

Titel:	Precision Glycomacromolecules with Hydrophobic Main Chain Motives
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=52290
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200303-141955-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Boden, Sophia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 120,81 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.02.2020 / geändert 16.02.2020
Beitragende:	Prof. Dr. Hartmann, Laura [Betreuer/Doktorvater] PD Dr. Schaper, Klaus [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Jede Zelle in lebenden Organismen ist von einem Zucker-Mantel, der sogenannten Glykokalyx, umgeben. Dieser Zucker-Mantel fungiert als Antenne der Zellen und ist an vielen wichtigen biologischen Signalübertragungen, wie der Zell-Zell-Kommunikation und/oder der Adhäsion von Pathogenen, beteiligt. Informationen werden in den komplexen Kohlenhydratstrukturen kodiert und dann durch die Bindung von Kohlenhydrat-erkennenden Proteinen, den Lektinen, entschlüsselt. Ein wichtiges Konzept, das diesen Kohlenhydrat-Lektin-Wechselwirkungen zugrunde liegt, ist die Multivalenz, wobei durch die Wechselwirkung mehrerer Bindungseinheiten des Kohlenhydrat Liganden als auch des Rezeptors, die normalerweise schwache Wechselwirkung zwischen einzelen Kohlenhydraten und Bindungstaschen verstärkt wird. Kürzlich haben Hartmann et al. gezeigt, dass sogenannte Präzisions-Glykomakromoleküle als vielversprechende Werkzeuge zur Untersuchung von Kohlenhydrat-Lektin-Wechselwirkungen dienen, um einen tieferen Einblick in die zugrundeliegenden multivalenten Effekte zu erlangen. Präzisionsglykomakromoleküle bestehen au einem Oligoamid Rückgrat mit angehängten Kohlenhydrat-Seitenketten und werden mithilfe der Festphasen Polymer Synthese (SPPoS), welche auf der klassischen Peptid Festphasessynthese von Merrifield basiert, dargestellt. Zusätzlich zu natürlichen Aminosäuren werden dabei synthetische Bausteine verwendet. Durch schrittweisen Aufbau dieser Bausteine auf der festen Phase wird ein monodisperses, sequenz-definiertes Oligoamid Rückgrat erhalten, welches Variationen in den funktionellen Gruppen der Haupt- und Seitenketten beinhaltet. Durch anschließende Konjugation eines Kohlenhydrat-Liganden an das Rückgrat, wird das Präzisionsglykomakromolekül erhalten, welches eine neue Klasse von multivalenten Glykomimetika repräsentiert, die als Liganden oder Inhibitoren von bakteriellen und viralen Lektinen fungieren. In dieser Arbeit werden drei Strategien verfolgt, um die Plattform der Präzisionsglykomakromoleküle zu erweitern: a) die Verwendung eines hydrophoben Bausteins im Rückgrat für zusätzliche sekundäre Wechselwirkungen mit dem Lektin, b) Anbringung von Glykomakromolekülen auf Gold Nanopartikeln (AuNPs) für eine weitere Verstärkung der Multivalenz und Anwendung in der gezielten Ansteuerung von Zellen, c) erste Experimente für die Verwendung von Glykomakromolekül-Fragmenten in dynamischen kombinatorischen Bibliotheken (Abbildung 1). Abbildung 1: Schematische Übersicht der verschiedenen Abschnitte dieser Arbeit. Im ersten Teil dieser Arbeit werden Präzisionsglykomakromoleküle mittels SPPoS synthetisiert, die in der Hydrophobizität des Rückgrats variieren. Die Änderung der Hydrophobizität des Rückgrats wird dadurch erreicht, dass ein hydrophober aliphatischer (ODS) (octyl – diamine – succinic acid) sowie ein hydrophober aromatischer Baustein (AR) (aromatisch) in Kombination mit dem standardmäßig verwendeten hydrophilen EDS (ethylene glycol – diamine – succinic acid) Spacer Baustein verwendet werden. Als Kohlenhydrat Einheit wird ein α-D-Mannose Azid Derivat gewählt, um das Modell Lektin Concanavalin A (ConA) und das bakterielle Lektin FimH anzusteuern. Die Bindungsaffinität zu den verschiedenen Glykomakromolekülen zu ConA wird mittels Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) und Isothermer Titrations Kalorimetrie (ITC) Messungen bestimmt. Zudem wird das Inhibierungspotenzial der verschiedenen Glykomakromoleküle durch die Verwendung eines Bakterien Adhäsions-Inhibierungs Experiments mit E. coli (Escherichia coli) FimH Rezeptoren untersucht. Eine NMR Studie und Dynamische Lichtstreuung (DLS) geben außerdem zusätzliche Einblicke in das Verhalten der Glykomakromoleküle in Lösung. Die Ergebnisse zeigen, dass höhere Bindungsaffinitäten sowie ein höheres Inhibitionspotenzial mit Glykomakromolekülen mit hydrophoben und aromatischen Eigenschaften im Rüchgrat erreicht werden. Die Zunahme in der Affinität kann vermutlich dadurch erklärt werden, dass zusätzliche sekundäre Wechslewirkungen mit hydrophoben Aminosäureseitenketten in der Nähe der Kohlenhydrat Bindungstasche sowie eine Änderung in der Konformation der Glykomakromoleküle in Lösung zum Tragen kommen. Die Änderung der Konformation wird dadurch erklärt, dass die Präsentation der Kohlenhydrate zur wässrigen polaren Ungebung, aufgrund der unvorteilhaften Exposition der hydrophoben Einheiten zur Lösung, bevorzugt wird. Basierend auf dem Ergebnis, dass hydrophobe Rückgrat Eigenschaften die Lektin Bindungsaffinität erhöhen, werden im zweiten Teil dieser Arbeit drei Glykomakromoleküle, die in Kohlenhydrat Anzahl und Rückgrat Hydrophobizität variieren, synthetisiert, um sie auf der Oberfläche von AuNPs zu präsentieren. Zusätzlich zu den synthetischen Bausteinen, ODS, EDS und TDS, werden in SPPoS natürliche Aminosäuren, L Cystein und L-Glycin, eingesetzt, um eine Thiol Funktionalität für die Anbringung an die Goldoberfäche sowie eine Säure Funktionalität für erhöhte kolloidale Stabilität der erhaltenen Glyko-Goldnanopartikel (Glyko-AuNPs) einzuführen. Auf diese Weise werden Glyko-AuNPs mit hohem Funktionalisierungsgrad und guter Stabilität in Puffer Lösungen erhalten. Die Bindungsaffinität der Glyko-AuNPs zu dem Modell Lektin ConA wird mittels UV-Vis Spektroskopie, DLS und SPR, basierend auf dem Aggregationsverhalten und des Inhibitionspotenzials in Gegenwart von ConA, untersucht. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen, die für Glykomakromoleküle in Lösung erhalten wurden, zeigen auch Glyko-AuNPs mit hydrophoben Eigenschaften im Rückgrat der präsentierten Glykomakromoleküle eine erhöhte Bindungsaffinität. Zusätzlich kann durch die multivalente Präsentation auf der Goldoberfläche ein größeres inhibitionspotenzial beobachtet werden als für die gleichen Liganden in Lösung. Im nächsten Teil dieser Arbeit wird das Glyko-Nanopartikel Konzept auf die Funktionalisierung von Gold-Nanopartikeln mit Lactose tragenden Glykomakromolekülen, die erneut in Kohlenhydrat Anzahl und Rückgrat Hydrophobizität variieren, erweitert. Diesmal werden die Glyko-AuNPs dazu verwendet, ihre in vitro Aktivität gegenüber des HIP/PAP oder Reg3A Proteins auf Krebszellen mittels Zellaufnahmestudien und Zelllokalisations Studien zu untersuchen. Erneut werden hoch stabile Glyko-AuNPs mit einem hohen Funktionalisierungsgrad, die zudem keinen negativen Einfluss auf die Zell Lebensfähigkeit haben, erhalten. Die Ergebnisse der Zellaufnahmestudien mittels Durchflusszytometrie und Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) zeigen, dass alle Glyko-AuNPs, unabhängig von der Struktur des Glykomakromoleküls, welches auf der Oberfläche präsentiert wird, in drei verschiedenen Zelllinien sehr ähnliche Aufnahmewerte aufweisen. Es gibt nur eine Ausnahme, die Präsentation des monovalenten Glykomakromoleküls mit hydrophoben aromatischen Spacing in direkter Nachbarschaft zu dem Kohlenhydrat tragenden TDS Baustein. Verschiedene Inhibitionsstudien werden durchgeführt, um Einblicke in die Gründe für dieses außergewöhnliche Verhalten zu erhalten, lassen allerdings keinen eindeutigen Schluss zu. Der dritte Teil dieser Arbeit befasst sich mit einer unterschiedlichen Herangehensweise, um ein hoch affines Glykomimetikum zu identifizieren. Anstatt verschiedene Serien von Glykomakromolekülen, die in verschiedenen Design Merkmalen variieren, zu synthestisieren und anschließend die Glykomakromoleküle mit höchster Affinität zu identifizieren, werden verschiedene Glykomakromolekül Komponenten in einer dynamischen Weise präsentiert, so dass in Gegenwart des Lektins die optimale Glykomimetikum Spezies gebildet wird (Abbildung 1). Dieser Ansatz basiert auf einer dynamischen kombinatorischen Bibliothek (DCL) von Glykomakromolekülen. Verschiedene reversible dynamische kovalente Bindungen, nämlich der Thiol-Disulphid Austausch und die Bildung von Iminen durch die Kondensationsreaktion von Aldehyden und Aminen, werden untersucht. Obwohl kleine Einflüsse auf die Zusammensetzung der dynamisch kombinatorischen Bibliothek in Gegenwart des Lektins beobachtet werden können, zeigen die beiden untersuchten Systeme noch nicht die optimalen Bedingungen für eine DCL, so dass in zukünftigen Arbeiten weitere Optimierungen notwendig sind. All cells in living organisms are surrounded by a sugar coat called the glycocalyx. This sugar coat represents the antennas of the cells and is involved in many important biological signal transduction processes such as cell cell communication and/or the adhesion of pathogens. The information is encoded in complex carbohydrate structures and then decoded by recognition of carbohydrate-recognizing proteins, termed lectins. An important concept underlying carbohydrate lectin recognition is multivalency, where only upon interactions of multiple carbohydrate and receptor sites, otherwise weak binding results in a strong signal. Recently, Hartmann et al. demonstrated that so called precision glycomacromolecules are a promising tool for studying carbohydrate lectin interactions and can be used to obtain deeper insight into the underlying multivalent effects that govern these processes. Precision glycomacromolecules consist of an oligoamide backbone with pending carbohydrate side chains and are synthesized by solid phase polymer synthesis (SPPoS) based on protocols of peptide synthesis as introduced by Merrifield. In addition to natural amino acids, artificial building blocks are employed in SPPoS. By stepwise assembly of these building blocks on solid support a monodisperse, sequence-defined oligoamide scaffold with varying functional groups in the main and side chains can be synthesized. Subsequent sugar conjugation results in precision glycomacromolecules which provide a new class of multivalent glycomimetics suitable as ligands and inhibitors of bacterial and viral lectins. In this thesis, three strategies to further develop the platform of precision glycomacromolecules are introduced: a) the introduction of hydrophobic motifs in the backbone to allow for secondary interactions in lectin binding, b) attaching glycomacromolecules onto gold nanoparticles (AuNPs) for further increase in multivalency and applications in cell targeting, c) first experiments towards dynamic combinatorial libraries of precision glycomacromolecule fragments (Figure 1). In the first part of the thesis precision glycomacromolecules gradually changing in backbone hydrophobicity are synthesized by SPPoS. The change in backbone hydrophobicity is achieved by introducing a hydrophobic aliphatic (ODS) (octyl – diamine – succinic acid) as well as hydrophobic aromatic spacer building block (AR) (aromatic) in combination with the regularly employed hydrophilic EDS (ethylene glycol – diamine – succinic acid) spacer building block. As carbohydrate moiety an α-D-mannose azide derivative is employed to target the model lectin Concanavalin A (ConA) and the bacterial lectin receptor FimH. Binding affinity of the different precision glycomacromolecules to ConA is assessed by surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC) measurements. Moreover, the inhibitory potency of the different glycomacromolecules is investigated employing a bacterial adhesion inhibition assay with the E. coli (Escherichia coli) FimH receptor. NMR and dynamic light scattering (DLS) are also employed to gain further information about glycomacromolecule behavior in solution. Results show higher affinities as well as higher inhibitory potential for glycomacromolecules with hydrophobic and aromatic moieties in the backbone. This increase in affinity is rationalized by additional secondary interactions with hydrophobic amino acid side chains near the carbohydrate recognition domain. Additionally, glycomacromolecules seem to adapt their conformation in solution in dependence of the hydrophobicity of the backbone, where carbohydrate ligands of glycomacromolecules with higher hydrophobicity in the backbone are more exposed to the solution phase due to unfavorable interactions of hydrophobic moieties with the aqueous surrounding. Figure 1: Schematic overview of the different parts of this thesis. Based on the finding that hydrophobic backbone properties increase lectin binding, in the second part of this work, a first set of three glycomacromolecules varying in carbohydrate valency and backbone hydrophobicity are employed for their presentation on AuNPs. In SPPoS natural amino acids L-cysteine and L-glycine are used in addition to artificial building blocks, ODS, EDS and TDS, in order to introduce a thiol group for attachment to the gold surface as well as the introduction of an acid end group to increase the colloidal stability of obtained glyco-AuNPs. In this way glyco-AuNPs are obtained that exhibit a high degree of functionalization and good stability in buffer solution. The binding affinity of glyco-AuNPs towards model lectin ConA is evaluated by applying UV-Vis spectroscopy, DLS and SPR to understand the aggregation behavior or inhibitory potential of glyco-AuNPs together with ConA. Results show that in comparison to the binding affinity of free glycomacromolecule compounds towards ConA, glyco-AuNPs presenting glycomacromolecules with hydrophobic backbone properties demonstrated increased affinity. In addition, multivalent presentation on the gold surface leads to an enhancemenht in binding affinity in comparison to the free ligand. In the next part of this thesis the glyco-nanoparticle concept is extended to the functionalization of gold nanoparticles with lactose bearing glycomacromolecules that again vary in carbohydrate number and backbone hydrophobicity. This time, their in vitro activity towards the HIP/PAP or Reg3A protein on cancer cells is evaluated by cellular uptake and subcellular localization studies. Again highly stable glyco-AuNPs with high degree of functionalization are obtained that additionally show no negative impact on cell viability. Results show that cell uptake determined by flow cytometry and inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) in different cell lines is similar irrespective of the glycomacromolecule structure presented on the surface, with one exception, the presentation of a monovalent glycomacromolecule with aromatic spacer next to the carbohydrate carrying TDS building block. Different inhibition studies are carried out to gather insights into the reasons for this exceptional behavior but result in no clear indication. The third part of the thesis presents a different approach for identifying high affinity glycomimetics. Instead of synthesizing a series of glycomacromolecules that vary in special design features in order to identify the glycomacromolecule with highest affinity, different glycomacromolecule components are presented to the lectin in a dynamic way so that the lectin itself can choose and help in the formation of the optimal glycomimetic species. This approach is based on a dynamic combinatorial library of glycomacromolecules. Different reversible dynamic bonds, namely the thiol-disulphide interchange and the formation of imines by the condensation reaction of aldehydes and amines, is tested. Even though small impacts of lectin presence on the constitution of the dynamic combinatorial library (DCL) can be observed the two systems still do not provide optimal DCL conditions requiring further optimization in future studies.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Organische Chemie und Makromolekulare Chemie
Dokument erstellt am:	03.03.2020
Dateien geändert am:	03.03.2020
Promotionsantrag am:	11.09.2019
Datum der Promotion:	22.11.2019