Dokument: Die Identifizierung von intrazellulären CFDA-Cisplatin-bindenden Proteinen

Titel:	Die Identifizierung von intrazellulären CFDA-Cisplatin-bindenden Proteinen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=52112
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200210-083854-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M.Sc Kotz, Sandra [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,75 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 28.01.2020 / geändert 28.01.2020
Beitragende:	Prof. Dr. rer. nat. Martin, William F. [Gutachter] Prof. Dr. rer. nat. Bauer, Inge [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Vor über 50 Jahren entdeckte Barnett Rosenberg die zytostatische Wirkung von Cisplatin. Bereits einige Jahre später wurden die ersten Krebspatienten im Rahmen einer Studie mit Cisplatin behandelt. Seit 40 Jahren ist die Behandlung mit Cisplatin ein fester Bestandteil der Krebstherapie. Gegenwärtig erfolgt eine Behandlung mit Cisplatin bei Plattenepithelkarzinomen an Kopf und Hals sowie beim Lungen-, Harnblasen-, Hoden- und Ovarialkarzinom (OC). Eine Platin-basierte Chemotherapie scheitert häufig an der Resistenz der Tumorzellen. Die Resistenz der Tumorzellen gegenüber Cisplatin hat vielfache Gründe und ist bis heute nicht vollständig verstanden. Da das reaktive Cisplatin bevorzugt mit schwefelhaltigen Aminosäuren interagiert, ist in den letzten Jahren die intrazelluläre Bindung von Cisplatin an Proteine in den Fokus der Forschung gerückt. In einer Tumorzelle existiert für Cisplatin eine Vielzahl von potentiellen Bindungspartnern. Daher ist das Ziel dieser Studie, einen geeigneten methodischen Ansatz zur Identifizierung von intrazellulären Cisplatin-Proteinaddukten zu etablieren und die funktionelle Bedeutung an ausgewählten Proteinen zu untersuchen. Für die Analyse wurde die humane OC-zelllinie A2780 und deren cisplatinresistente Tochterzelllinie A2780cis verwendet, da das OC derzeit mit der höchsten Sterblichkeitsrate aller gynäkologischen Malignome einhergeht. Da bislang die Identifizierung von Cisplatin-Proteinaddukten aus einer komplexen biologischen Probe erfolglos war, wurde die fluoreszierende Modellsubstanz CFDA-Cisplatin verwendet. Die Identifizierung von intrazellulären Bindungspartnern von Cisplatin wurde durch die Etablierung einer analytischen Methode, bestehend aus dem fluoreszierenden CFDA-Cisplatin, der 2D-Gelelektrophorese und Massenspektrometrie, ermöglicht. Um möglichst viele zytosolische Cisplatin-bindende Proteine identifizieren zu können, erfolgte die 2D-Gelelektrophorese getrennt für zwei verschiedene pH-Bereiche 4 - 7 und 6 - 10. Für die Identifizierung war die Optimierung einzelner Schritte der 2D-Gelelektrophorese unerlässlich, besonders für Proteine im alkalischen pH-Bereich (pH 6-10). Dadurch war die Identifizierung von EF1A1 (Elongation factor alpha-1) mit einem theoretischen pI von 9,10 als ein intrazellulärer Bindungspartner von Cisplatin möglich. Neben EF1A1 wurden sechs Cisplatin-bindende Proteine im sauren pH-Bereich sowie weitere sieben im alkalischen pH-Bereich identifiziert. Von den insgesamt 14 identifizierten intrazellulären Bindungspartnern von Cisplatin werden PDIA(Protein-Disulfid-Isomerase)1, PDIA3, GRP(Glucose-related-protein)78, EF1A1, ENOA (Alpha-Enolase), GAPDH (Glyceraldehyd-3-phosphate dehyrogenase), PKM (Pyruvatekinase) und PHGDH (D-3-phosphoglycerate-dehydrogenase) mit der Tumorentstehung in Verbindung gebracht. Kullmann et al. zeigte, dass ein siRNA-vermittelte Knockdown von GRP78 und PDIA3 die Cisplatin-induzierte Zytotoxizität in der Zelllinie A2780cis nicht beeinflusst wird und diese daher wahrscheinlich nicht an der erworbenen Cisplatinresistenz beteiligt sind. Zudem konnten wir zeigen, dass die spezifische Inhibierung von PDIA1 durch PACMA 31 einen potentiellen antitumoralen Therapieansatz darstellt. Dies muss in weiterführenden pharmakologischen Studien näher untersucht werden. More than fifty years ago, Barnett Rosenberg discovered the cytostatic effect of cisplatin. A couple of years later, the first cancer patients were treated with cisplatin in a study. For the last 40 years, treatment with cisplatin has been an integral part of cancer therapy. Currently, cisplatin is being used for squamous cell carcinoma in head and neck as well as in lung, bladder, testicular and ovarian carcinoma (OC). A platinum-based chemotherapy often fails because of resistance of tumor cells to the drug. Resistance to cisplatin is a multifactorial problem and is still not fully understood. Reactive cisplatin preferably interacts with sulfur-containing amino acids. Therefore, the intracellular binding of cisplatin to proteins has been the focus of research for several years. In tumor cells, cisplatin has a variety of potential binding partners. Consequently, the aim of this study is to establish a suitable methodological approach for the identification of intracellular cisplatin protein adducts and to investigate the functional importance of these selected proteins. For the analysis, the human OC cell line A2780 and its cisplatin-resistant subline A2780cis were used. The OC is currently associated with the highest mortality rate of all gynecological malignancies. So far the identification of cisplatin protein adducts from a complex biological sample has seen unsuccessful, that the fluorescent model substance CFDA-cisplatin was used. We established a method to detect and identify intracellular binding partners of cisplatin based on the fluorescent CFDA-cisplatin, 2D gel electrophoresis and mass spectrometry. To identify as many as possible cytosolic cisplatin-binding proteins, 2D gel electrophoresis was performed separately for two different ranges: pH 4-7 and pH 6-10. The optimization of each step of the 2D gel electrophoresis was essential, especially for proteins in the alkaline pH range (pH 6-10). After optimization the identification of EF1A1 (elongation factor alpha-1) with a theoretical pI of 9.10 as an intracellular binding partner of cisplatin was possible. In addition to EF1A1, six cisplatin-binding proteins in the acidic pH range and seven others in the alkaline pH range were identified. Of the total of 14 identified intracellular binding partners of cisplatin, PDIA (protein disulfide isomerase) 1, PDIA3, GRP (glucose-related protein) 78, EF1A1, ENOA (alpha-enolase), GAPDH (glyceraldehyd-3-phosphate dehyrogenase), PKM (pyruvate kinase) and PHGDH (D-3-phosphoglycerate dehydrogenase) were associated with tumorigenesis. Kullmann et al. demonstrated that siRNA-mediated knockdown of GRP78 and PDIA3 does not affect cisplatin-induced cytotoxicity in the A2780cis cell line, and therefore is unlikely to be involved in acquired cisplatin resistance. In addition, we were able to show that the specific inhibition of PDIA1 by PACMA 31 represents a potential antitumoral therapeutic approach. This must be further investigated in further pharmacological studies.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	10.02.2020
Dateien geändert am:	10.02.2020
Promotionsantrag am:	03.07.2019
Datum der Promotion:	07.01.2020