Dokument: Analyse der intrazellulären Lysine des Drosophila Notch-Rezeptors

Titel:Analyse der intrazellulären Lysine des Drosophila Notch-Rezeptors
URL für Lesezeichen:https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=52004
URN (NBN):urn:nbn:de:hbz:061-20200117-093817-5
Kollektion:Dissertationen
Sprache:Deutsch
Dokumententyp:Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:Text
Autor: Schnute, Björn [Autor]
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Dateien vom 16.01.2020 / geändert 16.01.2020
Beitragende:Prof. Dr. Klein, Thomas [Gutachter]
Prof. Dr. Aberle, Hermann [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:In dieser Arbeit wurde die Funktion der Ubiquitinierung des Notch-Rezeptors getestet. Dazu wurde ein transgener Rezeptor hergestellt, bei dem alle 27 intrazellulären Lysine durch die strukturell ähnliche Aminosäure Arginin ausgetauscht wurden (NK2R-HA).
Um zu testen, welchen Einfluss der Austausch der Lysine auf die Aktivität des Rezeptors hat, wurde eine Analyse mit Mutanten verschiedener Komponenten des Notch-Signalweges durchgeführt. Mit Hilfe dieser Analyse konnte gezeigt werden, dass NK2R-HA liganden-unabhängig aktiviert wird. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass diese Aktivierung unabhängig von der Funktion der Metalloprotease Kuz, aber abhängig von der Aktivität der γ-Sekretase erzeugt wird.
Lokalisationsstudien in der Flügelimaginalscheibe zeigten, dass der Austausch der Lysine keinen Einfluss auf die Sekretion und den Transport des Rezeptors an die apikale Membran hat. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass NK2R-HA über den endosomalen Weg transportiert wird und im Gegensatz zu N-HA an der limitierenden Membran von Kompartimenten mit endosomalem Ursprung akkumuliert. Die weitere Analyse zeigte Hinweise darauf, dass diese Lokalisation zu einer Aktivierung des Rezeptors führt, die unabhängig von der Fusion des Endosoms mit dem Lysosom ausgelöst wird. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass es durch den Austausch der Lysine zu einem verzögerten Abbau der intrazellulären Domäne im Zellkern kommt, der zu der starken ektopischen Aktivierung des Signalweges beiträgt.
In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass die E3-Ligasen Dx und Su(dx) eine ubiquitinierungs-unabhängige Endozytose des NK2R-HA Rezeptors auslösen. Zudem konnten Hinweise darauf erzielt werden, dass Su(dx) zu einer vermehrten Internalisierung von NK2R-HA in das endosomale Lumen führt und eine leichte Unterdrückung der ektopischen Aktivierung auslöst.
Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die Mutation eines konserviertes intrazellulären Dileucinmotiv zu einer reduzierten Endozytose des Notch-Rezeptors von der apikalen Membran führt. Der Austausch des Dileucinmotives im NK2R-HA Rezeptors führte ebenfalls zu einer reduzierten, aber keiner vollständigen Unterdrückung der Endozytose. Diese Beobachtungen deuten auf einen weiteren Mechanismus der Notch-Endozytose hin, der unabhängig von der Ubiquitinierung des Rezeptors und des Dileucinmotives ausgelöst wird.

In this thesis, the function of Notch receptor ubiquitination was analysed. For this purpose, a transgenic Notch receptor was generated in which all 27 lysines of the intracellular domain were replaced by the structurally similar amino acid arginine (NK2R-HA).
To test the impact of lysine replacement on receptor activity, several mutants of Notch signalling pathway components involved in activating the receptor were analysed. The results suggest that NK2R-HA is activated in a ligand independent manner. Moreover, it was shown that NK2R-HA signalling activity does not depend on the metalloprotease Kuz, but requires γ-secretase activity.
Localisation studies in wing imaginal discs showed that a replacement of lysines does not affect secretion and transport of the receptor to the apical membrane. NK2R-HA is transported via the endosomal pathway, but in contrast to N-HA remains at the limiting membrane of compartments with an endosomal origin. Further experiments indicated that NK2R-HA is activated at the limiting membrane independent of endosome/lysosome fusion. In addition, the replacement of intracellular lysines results in a delayed degradation of NICD in the nucleus, which contributes to the strong activation of the signalling pathway. It was further shown that the E3-ligases Dx and Su(dx) induce ubiquitination independent endocytosis of NK2R-HA. Moreover, there is evidence that Su(dx) expression leads to increased NK2R-HA internalisation into the endosomal lumen and triggers mild suppression of ectopic activation.
Mutation of a conserved intracellular dileucine motif resulted in a reduced internalisation of N-HA from the apical membrane. Replacement of this motif in NK2R-HA also showed a reduced, but not complete, suppression of endocytosis. These data suggest an alternative mechanism of Notch endocytosis, independent of receptor ubiquitination and the dileucine motif.
Lizenz:In Copyright
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Fachbereich / Einrichtung:Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:17.01.2020
Dateien geändert am:17.01.2020
Promotionsantrag am:15.11.2019
Datum der Promotion:19.12.2019
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