Dokument: Die EphB-Rezeptoren und ihre Funktion für den Podozyten

Titel:	Die EphB-Rezeptoren und ihre Funktion für den Podozyten
Weiterer Titel:	The EphB receptors and their function for the podocyte
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=51991
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200116-113105-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Haep, Nils [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 13,43 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 15.01.2020 / geändert 15.01.2020
Beitragende:	Prof. Dr. med. Sellin, Lorenz [Gutachter] PD Dr. med. Simon, Florian [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die Höhe der Proteinurie ist bei Nephropathien von großer prognostischer Bedeutung. Eine häufige Ursache der Proteinurie ist eine Schädigung des glomerulären Filters. Die Podozyten sind Bestandteil des glomerulären Filters und bilden zwischen ihren Fußfortsätzen die Schlitzmembran aus. Zwischen den Oberflächenproteinen gegenüberliegender Podozyten werden Mikroporen ausgebildet durch die der Primärharn aus dem Plasma filtriert wird. Diese durch Proteine gebildete Filtrationsbarriere befindet sich in einem dynamisch regulierten physiologischen Gleichgewicht zwischen Aufbau, Abbau, Adhäsion und Repulsion. Von großer Bedeutung für dieses Gleichgewicht ist die Nephrintyrosinphosphorylierung. In dieser Arbeit wurde der Effekt der EphB-Rezeptoren auf die Nephrintyrosinphosphorylierung und die damit verbundene Bedeutung für den Podozyten und die Schlitzmembran untersucht. Die Expression des EphB-Rezeptors und seines ephrinb-Liganden wurde in humanen und murinen Zellen mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion untersucht. Um Proteininteraktionen zu untersuchen, wurden Immunopräzipitationen durchgeführt und für Phosphorylierungsexperimente Src-Kinasen mit dem PP2-Kinaseinhibitor gehemmt. Um die Bedeutung von einzelnen Tyrosinen und Tyrosinkinasedomänen zu untersuchen, wurden modifizierte Proteine verwendet. Die SDS-Gelelektrophorese und der Western-Blot dienten zur Proteinanalyse. Die Nitrocellulosemembran wurde mit spezifischen Antikörpern inkubiert und mithilfe der Chemolumineszenz für die Densitometrie sichtbar gemacht. Wir konnten zeigen, dass die Liganden ephrinb1-3 und ihre Rezeptoren EphB1-3 in humanen und murinen Podozyten exprimiert werden. Unsere Ergebnisse zeigen eine Phosphorylierung des Oberflächenproteins Nephrin an Tyrosin 1176, 1193 und 1217 durch den EphB-Rezeptor und eine Beteiligung von Src-Kinasen. Die EphB-Rezeptor-vermittelte Nephrintyrosinphosphorylierung wird durch die Tyrosinkinasedomäne des EphB-Rezeptors vermittelt. Sie beeinflusst außerdem die Nephrin-b-Arrestin2 und die Nephrin-Nck2- Bindung. Unsere Ergebnisse indizieren eine Dephosphorylierung von Nephrintyrosin durch Stimulation der EphB-Rezeptoren mit dem ephrinb-Liganden. Es konnte eine Interaktion des EphB-Rezeptors mit Regulatorproteinen des Zytoskeletts gezeigt werden. Wir stellen folgende Hypothese auf: EphB-Rezeptoren haben eine regulatorische und stabilisierende Funktion auf die Schlitzmembran. Durch Tyrosinphosphorylierungen am Oberflächenprotein Nephrin wird die homodimere Bindung von Nephrinmolekülen mit gegenüberliegenden Podozyten bewirkt und die Schlitzmembran stabilisiert. Die Bindung des EphB-Rezeptors an seinen Liganden ephrinb führt zu einer Reduktion der Nephrintyrosinphosphorylierung und zur Durchlässigkeit des glomerulären Filters. Hierdurch ergibt sich ein dynamisches Regulationsmodell für ephrin und Eph an der Schlitzmembran. Nach der Bestätigung dieser Ergebnisse im Tiermodell stellt die ephrin- Eph-Familie ein potentielles Ziel für eine medikamentöse Therapie von glomerulären Erkrankungen dar. Proteinuria is highly relevant in nephropathies. A common cause for proteinuria is the damage of the glomerular filter. Podocytes are part of the glomerular filter and the slit membrane is formed between the podocyte`s foot processes. The surface proteins between adjacent foot processes form micropores through which the primary unrine is filtrated. This filtration barrier is formed by proteins dynamically regulated in a physiological balance between build-up, breakdown, adhesion and repulsion. The nephrin tyrosine phosphorylation is important for this equilibrium. We investigated the effect of the EphB receptors on the nephrin tyrosine phosphorylation and the significance for the podocyte and the glomerular filter. The expression of the EphB receptor and the ephrinb ligand was tested in human and murine cells via PCR (polymerase chain reaction). To test protein interactions immunoprecipitations have been performed. For phosphorylation experiments src kinases have been incubated with the PP2 kinase inhibitor. In order to test the significance of tyrosine kinase domains, modified cDNA was used. SDS electrophoresis and western blot were used for protein analysis. The membranes were incubated with specific antibodies and visualized for densitometric analysis. We were able to show that the ligands ephrinb1-3 and their receptors EphB1-3 are expressed in human and murine podocytes. Our results show a phosphorylation of the nephrin protein at its tyrosine’s 1176, 1193 and 1217 through the EphB receptor and src kinases. The nephrin tyrosine phosphorylation by the EphB receptor is mediated by its tyrosine kinase domain. The tyrosine kinase domain also mediates the nephrin-βarrestin2 binding and the nephrin- nck2 binding. Our results indicate a dephosphorylation of the nephrin tyrosine though stimulation of the EphB receptors with their ligand ephinb. Interaction of the EphB receptor with regulatory proteins of the cytoskeleton could be shown. We hypothesize that the EphB receptor has a regulatory and stabilizing function on the slit membrane. Through phosphorylation of the nephrin tyrosine a homodimer binding between adjacent podocytes stabilizes the slit membrane. The binding of the EphB receptor and its ligand ephrinb reduces nephrin tyrosine phosphorylation and increases permeability of the glomerular filter. This describes a dynamically regulated model for ephrin and Eph at the slit membrane. After confirmation of this model in vivo the ephrin-Eph family can be potential target for medical treatment of glomerular nephropathies.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	16.01.2020
Dateien geändert am:	16.01.2020
Promotionsantrag am:	24.04.2019
Datum der Promotion:	14.01.2020