Dokument: Charakterisierung des Redox-Proteoms der murinen C2C12 Skelettmuskelzelllinie
| Titel: | Charakterisierung des Redox-Proteoms der murinen C2C12 Skelettmuskelzelllinie | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=51981 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20200115-114157-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Grube, Leonie [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Stühler, Kai [Gutachter] Jun.-Prof. Dr. Beller, Mathias [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Redoxprozesse spielen bei einer Vielzahl von zellulären Signalwegen eine wichtige Rolle und ermöglichen den Zellen auf unterschiedliche Stimuli zu reagieren. Dabei können reaktive Sauerstoffspezies (ROS) innerhalb der Zelle als Signalmoleküle fungieren, die redox-sensitive Proteine über oxidative posttranslationale Modifikationen (oxPTM) verändern. Da oxPTM regulierend auf die Struktur, Aktivität, Lokalisation und Funktion von Proteinen wirken können, rückte die Untersuchung der oxPTM, insbesondere von reaktiven Cysteinthiolen in den letzten Jahren in den Fokus der Forschung. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung des Redox-Proteoms von Skelettmuskelzellen. Dafür wurde das Modellsystem der Palmitatbehandlung von murinen C2C12 Skelettmuskelzellen zur verstärkten Generierung von ROS verwendet.
Die Untersuchung des Modellsystems bestätigte, dass nach Palmitatbehandlung verstärkt ROS gebildet wurden und die Glukoseaufnahme der Zellen signifikant verringert war. Auf Ebene des zellulären Proteoms zeigte eine markierungsfreie massenspektrometrische Analyse, dass von den quantifizierten 2.371 Proteinen 830 nach Palmitatbehandlung einen signifikanten Abundanzunterschied aufwiesen, wobei erhöht abundante Proteine verstärkt mit dem biologischen Prozess der Signaltransduktion assoziiert waren. Im Rahmen der Arbeit konnte zudem erfolgreich ein Protokoll zur spezifischen Analyse von reversibel modifizierten Cysteinthiolen im Redox-Proteom von C2C12 Myotuben für die Anreicherung über eine Thiopropyl Sepharose Matrix auf Proteinebene etabliert werden. Über die Charakterisierung des Redox-Proteoms konnten 2.750 Proteine quantifiziert werden, von denen sich 378 als potentiell redox-sensitiv zeigten. Nach Palmitatbehandlung erhöht abundante Proteine können verstärkt mit Proteintransportprozessen, wie etwa der Proteinsekretion, in Zusammenhang gebracht werden. Anschließend wurde ergänzend der sekretorische Phänotyp von palmitatbehandelten C2C12 Myotuben untersucht. Dafür wurde erfolgreich ein Analyseansatz etabliert, mit dem 858 bona finde sekretierte Proteine identifiziert wurden, von denen 401 nach Palmitatbehandlung verändert abundant im Sekretom vorlagen. Die bioinformatorische Analyse ergab, dass ein Großteil der nach Palmitatbehandlung im Sekretom erhöht abundanten Proteine vermutlich über den Mechanismus der unkonventionellen Proteinsekretion freigesetzt wird, wohingegen klassisch sekretierte Proteine verringert abundant detektiert wurden. Die Kombination der Daten des sekretorischen Phänotyps und des Redox-Proteoms führte zur Identifizierung von 28 Proteinen, die potentiell redox-abhängig von C2C12 Skelettmuskelzellen sekretiert werden. Zu dieser Gruppe gehört das Protein Makrophagen-Migrations-Inhibitionsfaktor (Mif), das anschließend exemplarisch als Kandidatenprotein für ein redox-abhängig sekretiertes Protein mittels gezielter Cysteinmutation und nachfolgender Sekretions- und Interaktionsanalyse detailliert untersucht wurde. Im Rahmen dieser Arbeit konnten erstmals mittels proteomanalytischer Methoden redox-sensitive Proteine im Proteom von C2C12 Skelettmuskelzellen erfolgreich identifiziert werden, die Rückschlüsse auf potentiell redox-vermittelte extra- und intrazelluläre Prozesse liefern und möglicherweise dazu beitragen können, die Bedeutung von reversiblen Cysteinoxidationen im Zusammenhang mit fettsäureinduzierten Signalkaskaden und Proteinsekretionsprozessen besser zu verstehen.Redox processes are involved in a multitude of cellular signaling pathways and enable cells to respond to different external and internal stimuli. Within the cell reactive oxygen species (ROS) can act as signaling molecules by altering redox-sensitive proteins via oxidative posttranslational modifications (oxPTM). Since oxPTM effect the structure, activity, localization and function of proteins, the investigation of oxPTM at reactive cysteine thiols moved into the focus of research. The aim of this study was to characterize the redox proteome of skeletal muscle cells. For this purpose, the model system of palmitate treated C2C12 skeletal muscle cells was used to increase the generation of ROS. Investigation of the model system confirmed a significantly increased ROS level and a decreased glucose uptake of skeletal muscle cells after palmitate treatment. Labelfree mass spectrometric analysis of the cellular proteome yielded the quantification of 2.371 proteins whereof 830 showed a significant change in abundance after palmitate treatment. Proteins increased in their abundance are associated with the biological process of signal transduction. In addition, a protocol for the specific analysis of reversibly modified cysteine thiols in the redox proteome of C2C12 was successfully established. This protocol is based on enrichment of reversible oxidized cysteines on protein level using a thiopropyl sepharose matrix. This led to the quantification of 2.750 proteins containing 378 potentially redox-sensitive proteins. After palmitate treatment increased abundant proteins are primarily associated with protein transport processes such as protein secretion. Subsequently, the secretory phenotype of palmitate treated C2C12 myotubes was analyzed. Therefore, an analytical approach was successfully established and 858 bona fide secreted proteins were identified. 401 of these bona fide secreted proteins showed a significant change in abundance after palmitate treatment. Furthermore, bioinformatic analysis of those bona fide secreted proteins revealed that presumably high abundant proteins are released via the unconventional protein secretion mechanism and low abundant proteins by the classical protein secretion pathway. Combining secretory phenotype and redox proteome data revealed the identification of 28 potential redox-dependent secreted proteins. This group includes the protein macrophage migration inhibition factor (Mif). Subsequently, Mif was investigated as an exemplary candidate protein for redox-dependent secretion, using targeted cysteine mutation followed by secretion and interaction analysis. This work extensively contributes to the identification of redox-sensitive proteins in the proteome of C2C12 skeletal muscle cells using proteome analytical methods. These findings provide information on potentially redox-mediated extra- and intracellular processes and may contribute to a better understanding of the significance of reversible cysteine oxidations in the context of fatty acid-induced signal cascades and protein secretion processes. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 15.01.2020 | |||||||
| Dateien geändert am: | 15.01.2020 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 11.06.2019 | |||||||
| Datum der Promotion: | 10.09.2019 |
