Dokument: Development and molecular characterization of electrically active neuronal networks on microelectrode arrays for neurotoxicity testing in vitro

Titel:	Development and molecular characterization of electrically active neuronal networks on microelectrode arrays for neurotoxicity testing in vitro
Weiterer Titel:	Entwicklung und molekulare Charakterisierung von elektrisch aktiven neuronalen Netzwerken auf Mikroelektroden Arrays für in vitro Neurotoxizitätstestung
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=51853
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200115-112150-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl. Biol. Nimtz, Laura [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,69 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.12.2019 / geändert 20.12.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Fritsche, Ellen [Gutachter] Prof. Dr. Urlacher, Vlada [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die aktuellen Analysen der entwicklungstoxikologischen Tests gemäß den Richtlinien der OECD oder der US-amerikanischen EPA, zeigt, dass diese primär in Tierversuchsstudien durchgeführt werden. Die dabei angewandten Methoden sind zeit- und ressourcenintensiv und hinsichtlich der Übertragung von Ergebnissen zwischen verschiedenen Spezies problematisch. Aufgrund der benötigten hohen Menge an Versuchstieren, ist es unmöglich, die große Anzahl an Chemikalien in wissenschaftlichen Experimenten an oder mit lebenden Tieren zu testen. Daher wird ein Paradigmenwechsel angestrebt, der von einer apikalen Endpunktbewertung bei Nagetieren zu humanrelevanten Wirkmechanismen innerhalb alternativer In-vitro-Tests geändert wird. Ein Organ mit hohen Ausschlussraten für die Vorhersage von Risiko und Wirksamkeit potenziell toxischer Substanzen ist das zentrale Nervensystem (ZNS). Daher sind alternative Methoden gefordert, mit denen die Auswirkungen auf humane Gehirnzellen präzise vorhergesagt werden können. Die beiden in dieser Arbeit enthaltenen Reviews fassen die Entwicklung und Verfügbarkeit alternativer Invitro-Konzepte auf der Basis menschlicher Stammzellen für eine Endpunktbewertung zusammen. Für eine Assay-Etablierung sollten solche Endpunkte ausgewählt werden, die (i) zum Aufbau einer auf Stammzellen basierenden DNT-Testbatterie verwendet werden können und räumlich-zeitliche neurologische Entwicklungsprozesse abdecken; (ii) ferner die Vorhersagbarkeit für den Menschen verbessern und (iii) regulatorische Anforderungen erfüllen. Darüber hinaus enthält diese Dissertation zwei Forschungsmanuskripte, welche die biologische Charakterisierung von aus human-induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (hiNPC) aufzeigen. Diese hiNPC sind in 3Dschwimmenden Sphäroiden, den sogenannten Neurosphären, organisiert und differenzieren spontan zu einer heterogenen Ko-Kultur aus Neuronen und Astrozyten. Diese bilden zusammen ein elektrophysiologisch aktives neuronales Netzwerk. Analysen von immunzytochemischen Färbungen und mRNA-Expressionsprofilen zeigen, dass die neuronalen Netzwerke Prä- und Postsynapsen exprimieren und bestimmte subtypspezifische neuronale Rezeptoren und Enzyme ausbilden. Beim Ausplattieren dieser hiNPC auf Einzelwell- oder Multiwell-Mikroelektrodenarrays (MEAs), die zuvor mit einer extrazellulären Matrix beschichtet wurden, zeigen sich im Laufe der Zeit elektrische Aktivitäten (Spikes und Bursts) und erste vereinzelte Netzwerk-Synchronitäten. Die pharmakologische Behandlung der Netzwerke bestätigt das Vorhandensein und die Funktionalität von inhibitorischen GABAergen Synapsen, allerdings wird auch ein Mangel an einer glutamatergen Reizweiterleitung deutlich. Die Ergebnisse zeigen, dass hiNPCabgeleitete neuronale Netzwerke durchaus einen Beitrag für eine In-vitro-Testbatterie zur Neurotoxizitätsbewertung leisten können. Today developmental toxicity testing is mostly performed on animals according to guidelines from the OECD or U.S. EPA. These methods are time and resource-intensive and bear the problem of inter-species extrapolation. Due to the anticipated resources, it is impossible to test the large number of chemicals needed in such animal studies. Therefore a paradigm shift in toxicological testing from apical endpoint evaluation in rodents towards mode-of-action (MoA)-based, human-relevant in vitro testing is strived for. One organ with high failure rates for effect prediction for safety as well as efficacy is the central nervous system (CNS). Thus alternative methods are needed that predict compounds’ effects on human brain cells with high accuracy. The two reviews included in this thesis summarize the in vitro development and availability of alternative human stem cell-based scientific concepts for endpoint evaluation. Here for assay establishment neurodevelopmental endpoints should be chosen that (i) can be used to set up a stem cell-based DNT testing battery covering spatiotemporal neurodevelopmental processes, (ii) increase predictivity for humans and (iii) accomplish regulatory requirements. Furthermore, this thesis contains two research manuscripts revealing the cell biological characterization of human induced pluripotent stem cell-derived neural progenitor cells (hiNPC). These hiNPC are organized as 3D-floating spheroids, so called neurospheres, and differentiate spontaneously into a heterogeneous co-culture of neurons and astrocytes, forming electrophysiologically active neuronal networks. Analyses of immunocytochemical stainings and mRNA expression profiles demonstrate that neuronal networks express pre- and postsynaptic molecules as well as certain neuronal subtype-specific receptors or enzymes. Upon plating on extracellular matrix-coated single- or multi-well microelectrode arrays (MEAs), neurons exhibit electrical activity (spikes and bursts) and network synchronicity over time. Treating networks with pharmacological compounds indicates presence and functionality of inhibitory GABAergic synapses but lack of glutamatergic transmission. These data suggest that hiNPC-derived neuronal networks are suited to contribute to a battery of test methods for neurotoxicity evaluation in vitro
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	15.01.2020
Dateien geändert am:	15.01.2020
Promotionsantrag am:	26.06.2019
Datum der Promotion:	06.12.2019