Dokument: Entwicklung und Etablierung einer TaqMan Real Time PCR zur Verbesserung und Vereinfachung der Diagnostik der urogenital relevanten Krankheitskeime U. urealyticum, U. parvum,

Titel:	Entwicklung und Etablierung einer TaqMan Real Time PCR zur Verbesserung und Vereinfachung der Diagnostik der urogenital relevanten Krankheitskeime U. urealyticum, U. parvum,
Weiterer Titel:	Development and establishment of TaqMan real-time PCR to improve and simplify the diagnosis of the urogenital relevant infectious agents U. urealyticum, U. parvum, M. hominis and M. genitalium.
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=5173
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20070723-082248-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Brenneisen, Wibke [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 477,9 KB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.07.2007 / geändert 17.07.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Henrich, Birgit [Gutachter] Prof. Dr. Hampl, Monika [Gutachter]
Stichwörter:	Real Time PCR, Mycoplasmen, Ureaplasmen
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibung:	Urogenitale Krankheitserreger wie Mycoplasma hominis, M. genitalium, Ureaplasma urealyticum und U. parvum wurden bisher mit Hilfe der kulturellen Anzucht nachgewiesen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine Real Time PCR entwickelt, um ihren Nachweis zu verbessern. Vorteile gegenüber herkömmlichen Kultivierungsverfahren bietet die Real Time PCR, da sie den speziesspezifischen Nachweis und eine Quantifizierung der nachgewiesenen Genomäquivalente und somit die Berechnung der Keimzahl in einer Patientenprobe ermöglicht, was speziell bei fakultativ-pathogenen Keimen wie Ureaplasmen und M. hominis entscheidend für die ätiologische Bedeutung und auch für mögliche therapeutische Konzepte sein kann. Mithilfe des Computerprogramms „Primer Express“ wurden geeignete Primer und Sonden für die Ureaplasmenspezies U. urealyticum und U. parvum (Ureasegen) sowie für M. genitalium (tuf-Gen) und M. hominis (P80-kodierendes hitA-Gen) ermittelt. Theoretisch (durch Datenbankabgleich) wie praktisch (durch Tests auf Kreuzreaktivität) erwiesen sich die ausgewählten Primer als speziesspezifisch. Um die in der TaqMan PCR amplifizierte Bakterien-DNA quantifizieren zu können, wurde durch Klonierung des Amplikons in ein Plasmid für jeden der vier Erreger eine standardisierte Probe erzeugt, deren DNA-Menge bekannt war und unter deren Einsatz computergestützt die DNA-Menge in jeder unbekannten Probe errechnet werden konnte. Als Positivkontrolle wurde das humane GAPDH-Gen verwendet, da mit jedem Abstrich auch humane Zellen entnommen werden. Anfängliche Probleme, die sich aus der geringen Stabilität bzw. Haltbarkeit der Bakterien-DNA ergaben, konnten mit verbesserten Aufarbeitungsmethoden größtenteils behoben werden. So stellte sich der Proteinase-K-Aufschluß in mehreren Versuchsreihen als die beste Aufbereitungsmethode für Mycoplasmen und Ureaplasmen heraus. Für das Jahr 2003 wurden die Ergebnisse der Ureaplasmen- und Mycoplasmendiagnostik mittels kulturellen Nachweises mit der parallel durchgeführten Real Time PCR verglichen. Hierbei stellte sich eine Übereinstimmung von 97,4% bei den Ureaplasmen und 96,5% bei den Mycoplasmen heraus. Betrachtet man die kulturelle Anzucht als Goldstandard, so ergibt sich für die Ureaplasmen eine Sensitivität der Real Time PCR von 89% und eine Spezifität von 99%. Bei den Mycoplasmen beträgt die Sensitivität 62% und die Spezifität 98%. Im Vergleich der einzelnen Spezies mit den hervorgerufenen Erkrankungen, konnte festgestellt werden, dass von allen positiv befundeten Mollicutes 70 % von U. parvum stammten. Weiterhin fiel auf, dass bei Komplikationen in der Schwangerschaft wie beispielsweise Frühgeburtlichkeit oder vorzeitige Wehentätigkeit als einzige Mycoplasmenspezies U. parvum vorkam. Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte und seitdem im Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene in Düsseldorf etablierte Real Time PCR bietet als sensitive Methode durch ihre Speziesspezifität entscheidende Vorteile gegenüber der herkömmlichen kulturellen Diagnostik. In Weiterentwicklung der RealTime PCR – Technologie wird die Multiplex- RealTime PCR heute standardmäßig für die Diagnostik urogenital relevanter Mollicutes durchgeführt. Hierbei werden zwei Erreger in einer PCR-Reaktion detektiert, wobei jeweils der U. urealyticum - mit dem U. parvum - und der M. hominis - mit dem M. genitalium – Nachweis kombiniert wird. Im Hinblick auf Spezifität und Sensitivität ist die Multiplex –PCR mit den Einzelnachweisen vergleichbar, zeichnet sich jedoch durch eine signifikante Material- und somit Kostenersparnis aus.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Medizinische Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	17.07.2007
Dateien geändert am:	17.07.2007
Promotionsantrag am:	15.11.2006
Datum der Promotion:	12.06.2007