Dokument: Multicolour fluorescence in situ hybridization in cervical smears: detection of amplification of hTERC, MYC, and EGFR for the diagnosis of intraepithelial neoplasia.

Titel:	Multicolour fluorescence in situ hybridization in cervical smears: detection of amplification of hTERC, MYC, and EGFR for the diagnosis of intraepithelial neoplasia.
Weiterer Titel:	Mehrfarben Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung in Cervix-Abstrichen: Nachweis der Amplifikation von hTERC, MYC und EGFR zur Diagnose von intraepithelialen Neoplasien.
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=51710
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20191217-114413-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Silva de Araujo, Bruno Eduardo [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,92 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 04.12.2019 / geändert 04.12.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Biesterfeld, Stefan [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Hampl, Monika [Gutachter]
Stichwörter:	FISH; Cervix; Cancer; hTERC; MYC; EGFR
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Einleitung: Die Einführung der zytologischen Krebsvorsorge hat weltweit zu einem Rückgang der Zahl der Todesfälle durch das Zervixkarzinom geführt. Die kostengünstige und einfach durchzuführende zytologische Untersuchung von Zervixabstrichen ermöglicht bereits die Erkennung von präkanzerösen Läsionen, wodurch in vielen Fällen ein Fortschreiten zu einem invasiven Karzinom vermieden werden kann. Die Zytologie ist sehr spezifisch bei allerdings verbesserungsbedürftiger Sensitivität, was bei der Wahl des Vorsorgeintervalls zu beachten ist. Die Zielläsion des Vorsorgeprogramms in Deutschland ist die zervikale intraepitheliale Neoplasie Grad 3 (CIN3), welche einer obligaten Präkanzerose entspricht. Diese kann kolposkopisch mittels Konisationsverfahren reseziert werden. Frühere Vorläuferläsionen (CIN1 oder CIN2) haben eine wesentlich höhere Regressionsneigung und werden daher zunächst durch regelmäßige zytologische Untersuchungen überwacht. Dieser Prozess kann jedoch zu einer psychischen Belastung der Patientinnen führen, die je nach Algorithmus bis zu 6 Monate, ggf. wiederholt, bis zur erneuten Kontrolle warten müssen, um Antworten auf die Entwicklung der Läsion zu erhalten. Entsprechend wären alternative, die Zytologie ergänzende Methoden erforderlich, die früher und genauer das biologische Verhalten einer intraepithelialen zervikalen Läsion vorhersagen können. Viele dieser Methoden benötigen aber eine hohe Anzahl von verdächtigen Zellen oder erlauben keine Untersuchung an bereits mikroskopisch untersuchten auffälligen Zellen. Die Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) bietet sich als geeignete Alternative an, da sie bereits bei einer geringen Anzahl erforderlicher Analysezellen maligne Läsionen mit hoher Genauigkeit detektieren kann. Darüber hinaus besteht die Möglichkeit, Zytologie und FISH nacheinander auf demselben Objektträger durchzuführen und auf diese Weise morphologische und genetische Informationen einer Läsion zusammenzuführen. Ziel der Studie ist die Analyse des Potenzials der FISH als Bestätigungstest für eine maligne Transformation in dysplastischen Zellveränderungen der Cervix uteri. Methodik: Für unsere retrospektive Fall-Kontroll-Studie verwendeten wir Zervixabstriche von 132 Frauen, die von Januar 2014 bis August 2015 an der Klinik für Frauenheilkunde und Geburtshilfe der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, meist in der Dysplasieprechstunde, behandelt wurden. Die Fälle wurden nach ihrer zytologischen Diagnose entsprechend der Gruppen I, IIp, IIID1, IIID2, IVa-p und V der Münchner Nomenklatur III ausgewählt. Gemäß einer Stichprobenschätzung wurden initial für jede Gruppe 25 Patienteninnen vorgegeben. Die Interphase FISH wurde mit drei genortspezifischen Sonden durchgeführt: LSI MYC SpectrumAqua Probe (8q24.21), LSI TERC SpectrumGold Probe (3q26) und LSI EGFR SpectrumGreen Probe (7p11.2-p12). Die FISH-Ergebnisse und die zytologischen Diagnosen wurden mit den korrespondierenden histologischen Diagnosen (Biopsien (n=126), Konisationen (n=28), Hysterektomiepräparate (n=4)) verglichen, wobei der Zeitpunkt der Biopsie innerhalb von 3 Monaten und der Konisation (oder Hysterektomie) innerhalb von 6 Monaten nach der zytologischen Diagnose liegen musste. Außerdem wurden der klinische Verlauf und, soweit durchgeführt, das Ergebnis eines HPV-Tests (innerhalb von 6 Monaten nach dem zytologischen Abstrich) den Krankenakten entnommen. Die folgenden statistischen Variablen wurden für die Bewertung der diagnostischen Treffsicherheit der FISH bestimmt: Sensitivität, Spezifität, positiver und negativer prädiktiver Wert sowie die Fläche unter der ROC-Kurve (AUC). Ergebnisse: Die Definition des zur Abgrenzung eines positiven von einem negativen FISH-Resultat erforderlichen Cutoffs erfolgte zunächst ausschließlich auf Basis der statistischen Analyse (Youden-Index). Da die Cutoffs dieser Analysen zu hoch waren (zum Teil mehr als 30 erforderliche genetisch veränderte Zellen) oder die Spezifität unter 90% lag, wurden zusätzliche Analysen zur Findung geeigneter Cutoff-Werte für die klinische Anwendung durchgeführt. Die Veränderung der Cutoffs zeigte zwar bessere Ergebnisse, die aber immer noch unter den Anforderungen einer klinischen Anwendung lagen. Hierbei zeigte sich als Problem, dass bei vielen Fällen (n=94), wie auch in der Literatur üblich, die histologische Biopsie als Referenzstandard verwendet wurde. Diese muss nicht unbedingt für die Gesamtläsion repräsentative Veränderungen aufweisen. Deswegen wurden ergänzend als Teilanalyse die FISH Untersuchungen in Bezug auf die histologischen Diagnosen nach Konisation als besser geeignetem Referenzstandard ausgewertet. Diese Art der Analyse lieferte erwartungsgemäß die besten Ergebnisse. Ein positives FISH-Ergebnis unter Verwendung eines vordefinierten Cutoffs von ≥10 genetisch auffälligen Zellen erreichte nach Korrelation mit der histologischen Diagnose der Konisation ≥CIN2 eine Sensitivität von 78,6% und eine Spezifität von 92%. Diese für das Gesamtkollektiv ermutigenden Ergebnisse konnten in Subgruppenanalysen in den für eine FISH-Anwendung ebenfalls interessantesten Diagnosegruppen IIp, IIID1 oder IIID2 allerdings nicht bestätigt werden. Perspektive: Die Studie lieferte nützliche Informationen bezüglich der grundsätzlichen Anwendbarkeit von FISH-Sonden an Zervixabstrichen. Es wurde gezeigt, dass der Nachweis von genetischen Veränderungen mittels FISH als Methode zur Abschätzung einer tatsächlich vorliegenden mindestens CIN2 Läsion eine gute diagnostische Treffsicherheit aufweist, wenn ein bezüglich der Diagnosegruppen gemischtes zytologisches Kollektiv untersucht wird. Für eine Anwendung an definierten zytologisch unklaren Diagnosegruppen, z.B. IIID1, ist die klinische Anwendbarkeit mit der oben genannten Sondenkombination noch nicht gegeben. Dennoch wurden Faktoren herausgearbeitet, die die Ergebnisse möglicherweise negativ beeinflussen, wie etwa die geringe Qualität der Abstriche (oft suboptimale alkoholische Fixation) und die Problematik des repräsentativen Referenzstandards im Falle einer histologischen Biopsie. Die Einführung der flüssigkeitsbasierten Zytologie und die Wahl eines längeren klinischen follow-up-Zeitraumes könnten hier Verbesserungen in der Aussagekraft der FISH-Resultate bringen. Die Hinzunahme einer vierten FISH-Sonde und deren kombinierte Auswertung, wie bereits für andere Organsysteme (Lunge, Gallenwege, Urinzytologie) publiziert und in der klinischen zytologischen Diagnostik anwendbar, könnte die Treffsicherheit der Methode ebenfalls verbessern und sollte in zukünftigen Arbeiten erprobt werden. Introduction: The introduction of cytological cervical cancer screening has reduced the number of cervical cancer deaths worldwide. The inexpensive and easy-to-use cytopathological examination of cervical smears enables the detection of precancerous lesions, which in many cases can prevent progression to invasive carcinoma. Cytology is highly specific, but sensitivity is in need of improvement, which has to be considered when choosing the precautionary interval. The target lesion of the screening program in Germany is cervical intraepithelial neoplasia grade 3 (CIN 3), which corresponds to obligatory precancerous disease. These lesions can be resected using conisation procedures. Earlier precursor lesions (CIN 1 or CIN 2) have a much higher tendency for regression and are therefore preferably monitored by regular cytological examinations. This process can, however, lead to a psychological strain on the patients, who, depending on the algorithm, have to wait up to 6 months, repeated if necessary, until they are checked again in order to obtain answers to the development of the lesion. Thus, alternative methods complementary to cytology are required to predict the biological behavior of an intraepithelial cervical lesion earlier and more accurately. Many of these methods, however, require a high number of suspicious cells or do not allow examination of already microscopically examined abnormal cells. Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a suitable alternative because it can detect a malignant lesion with high accuracy even with a small number of required analysis cells. It is also possible to perform cytology and FISH sequentially on the same slide and thus to combine morphological and genetic information of a lesion. The aim of the study is to analyze the potential of FISH as a confirmatory test for malignant transformation in dysplastic cell changes of the uterine cervix. Methods: For our retrospective case control study, we used cervical smears from 132 women treated at the Department of Obstetrics and Gynecology of Heinrich Heine University, Düsseldorf, from January 2014 to August 2015, mostly in the dysplasia consultation ambulance. The cases were selected due to their cytological diagnosis according to groups I, IIp, IIID1, IIID2, IVa-p, or V, respectively, of the Munich Nomenclature III. Resulting from a sample size estimation, 25 patients were initially determined for each group. The interphase FISH was performed with three locus-specific probes: LSI MYC SpectrumAqua Probe (8q24.21), LSI TERC SpectrumGold Probe (3q26) and LSI EGFR SpectrumGreen Probe (7p11.2-p12). The FISH results and the cytological diagnoses were compared with the corresponding histological diagnoses (biopsies (n=126), conisations (n=28), hysterectomy specimens (n=4)), whereby the time of biopsy had to be within 3 months and the time of conisation (or hysterectomy) within 6 months after the cytological diagnosis. In addition, the clinical course and, if performed, the result of an HPV test were taken from the patient's records within 18 months of the cytological smear. The following statistical variables were used to evaluate the diagnostic accuracy of FISH: Sensitivity, specificity, positive and negative predictive value and area under the ROC curve (AUC). Results: The definition of the cutoff required to distinguish a positive from a negative FISH result was initially based exclusively on statistical analysis (Youden index). Since the cutoff values of these analyses were too high (sometimes more than 30 required genetically modified cells) or the specificity was below 90%, additional analyses were performed to find better suited cutoff values for clinical application. Although the active modification of the cutoffs showed better results, they still remained lower than the requirements of clinical application. In many cases (n=94), the histological biopsy was used as a reference standard, as is usual in the literature. However, biopsies will not always be representative for the lesion as a whole. Thus, the FISH examinations with histological diagnoses after conisation were evaluated as a more suitable reference standard as a partial analysis. As expected, this type of analysis provided the best results. A positive FISH result using a pre-defined cutoff of ≥10 genetically abnormal cells correlated with the histological diagnosis of conization ≥CIN2 achieved a sensitivity of 78.6% and a specificity of 92%. However, these results, which were encouraging for the overall collective, could not be confirmed in subgroup analyses in the diagnostic groups IIp, IIID1 or IIID2 which are also interesting for FISH application. Perspective: The study provides valuable information on the basic applicability of FISH probes to cervical smears. It has been shown that the detection of genetic alterations using FISH as a method for estimating an actual at least CIN2 lesion has good diagnostic accuracy when examining a mixed cytological collective of diagnostic groups. For an application on defined cytologically unclear diagnostic groups, e. g. IIID1, the clinical applicability with the above mentioned probe combination is not yet proved. Nevertheless, factors were identified that might negatively influence the results, such as the low quality of the smears (often suboptimal alcoholic fixation) and the problem of the representative reference standard in the case of a histological biopsy. The introduction of liquid-based cytology and the choice of a longer clinical follow-up period could improve the significance of the FISH results. The addition of a fourth FISH probe and its combined evaluation, as already published for other organ systems (lung, biliary tract, urinary cytology) as applicable for routine cytodiagnostics, could also improve the accuracy of the method and should be tested in future work.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Cytopathologie
Dokument erstellt am:	17.12.2019
Dateien geändert am:	17.12.2019
Promotionsantrag am:	29.05.2019
Datum der Promotion:	22.10.2019