Dokument: Untersuchung zum Einfluss β₃-mimetischer Peptide auf das Adhäsionsverhalten humaner Thrombozyten in Relation zum Leu33/Pro33-Polymorphismus des Integrins αIIbβ₃
| Titel: | Untersuchung zum Einfluss β₃-mimetischer Peptide auf das Adhäsionsverhalten humaner Thrombozyten in Relation zum Leu33/Pro33-Polymorphismus des Integrins αIIbβ₃ | |||||||
| Weiterer Titel: | Investigation of the influence of β₃-mimetic peptides on adhesion behavior of human platelets in relation to the Leu33 / Pro33 polymorphism of the integrin αIIbβ₃ | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=51708 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20191204-133625-4 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Neuhann, Julia Maria [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Hubert Schelzig [Gutachter] Prof. Dr. Thomas Hohlfeld [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Kindlin-3; Integrinalpha2bbeta3; mimetische Peptide; HIV-TAT; Talin | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Thrombozytäre Integrinrezeptoren, wie das Membran-dominierende αIIbβ3 Integrin, sind essentiell für eine adäquate Thrombozytenfunktion im Zuge der Hämostase. Sie können aber, bei Dysfunktion, unter anderem in Form gestörter Aggregation, ursächlich an der Entstehung thromboembolischer bzw. hämorrhagischer Ereignisse beteiligt sein. Der HPA-1-Polymorphismus (Leu33/Pro33-Polym.) des αIIbβ3-Rezeptors steht bei homo- zygoten Trägern des HPA-1b-Allels für eine erhöhte Thrombogenität, die sich klinisch u.a. in einer vorzeitigen Inzidenz eines akuten Myokardinfarkts äußert. Die zytoplasmatische β3-Untereinheit des αIIbβ3-Rezeptors interagiert im Zuge der Integrin-Aktivierung mit vielen Signal- und Zytoskelettproteinen, einschließlich Kindlin-3. Ein Verlust von β3- Wechselwirkungen mit dem Adaptorprotein Kindlin-3 kann eine fehlerhafte Signalweiterleitung und in der Folge eine gestörte Thrombozytenfunktion verursachen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Potenzial mimetischer Peptide und deren Einflussnahme auf die Rolle des Kindlin-3 in der Signalkaskade zu untersuchen. Die Untersuchungen dazu wurden anhand der statischen Adhäsion auf Fibrinogen und Fibronektin an humanen Thrombozyten durchgeführt. Dabei lag der Fokus auch auf der Untersuchung der beiden Genvarianten des HPA-1-Polymorphismus. In diesem Rahmen wurde initial ein Protokoll zum Einsatz β3-mimetischer Peptide für die Bindungsstelle von Kindlin-3 an der β3-Untereinheit des Integrinrezeptors αIIbβ3 entwickelt. Die Internalisierung der Peptide wurde lasermikroskopisch nach FlAsH-Labeling nachgewiesen. Darauf aufbauend wurden in mehreren Untersuchungsreihen die geeigneten Konzentrationen bzw. Inkubationsbedingungen mittels Aggregometrie und Fluoroscan für beide Genvarianten ermittelt. Nach Protokolletablierung wurde dann in einem weiteren Schritt an Thrombozyten aus Spenderblut von homozygoten HPA 1a/1a- bzw. HPA 1b/1b- Trägern die Wirkung β3-mimetischer Peptide auf das statische Adhäsionsverhalten auf Fibrinogen und Fibronektin mittels quantitativer Fluoreszenzmessungen (n=25) und Lasermikroskopie untersucht.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen bezüglich des generellen Einsatzes mimetischer Peptide, dass die Peptide zum einen die komplexe Membranbarriere der Thrombozyten überwinden können und dass sie zum anderen einen stark unterschiedlichen spezifischen Einfluss auf die Thrombozytenadhäsion und Thrombozytenaggregation beider Genvarianten haben. Bei der HPA 1a/1a-Variante ließ sich ein signifikant inhibitorischer Effekt auf die Thrombozytenadhäsion nach der Applikation β3-mimetischer Peptide für die Bindungsstelle von Kindlin-3 nachweisen, ein Effekt, der bei Weiterverfolgung dieser Untersuchungsrichtung die Möglichkeit zukünftiger pharmakologischer Therapien impliziert. Im Gegensatz dazu fand sich im Falle von Thrombozyten der HPA 1b/1b- Variante eine signifikant inverse Reaktion in Form einer - aufgrund der bisherigen Literatur unerwarteten und hier erstmals beschriebenen - gesteigerten statischen Adhäsion auf beiden Liganden Fibronektin mit einer Steigerung um 30% und Fibrinogen um 56%. Die aggregometrischen Untersuchungen im Rahmen der Protokolletablierung bestätigten diesen Trend. Auf Fibrinogen zeigten Thrombozyten der HPA-1b-Variante diesbezüglich durchgehend ein höheres Adhäsionspotenzial. Der inhibitorische Effekt β3-mimetischer Peptide auf Thrombozyten der HPA-1a-Variante war in unserem Experimentalansatz für beide Liganden mit einer Reduktion der statischen Adhäsion auf -22% gleich. Im Rückschluss scheint Kindlin-3 1.) in der Signalkaskade der αIIbβ3 Integrin-Aktivierung eine Adhäsions-limitierende und 2.) eine Polymorphismus-spezifische Rolle zu spielen. Es ergeben sich neue Hypothesen, die in dieser Arbeit diskutiert werden. Der erfolgreiche Ersteinsatz β3-mimetischer Peptide für die Bindungsstelle von Kindlin-3 macht vertiefende (z.B. rheologische) Untersuchungen im Zuge einer in Zukunft möglichen Pharmakotherapie Erfolg versprechend und fordert zudem für ein späteres pharmakologisches Sicherheitsprofil den weiteren Vergleich beider Genvarianten.Platelet integrin receptors like membrane-dominating αIIbβ3 integrin are essential to ensure adequate platelet function during haemostasis. In case of a dysfunction, e.g. impaired aggregation, they can, however, be a causative factor of thromboembolic or haemorrhagic events. In homozygous carriers of the HPA-1b allele, the HPA-1 polymorphism (Leu33/Pro33 polymorphism) of the αIIbβ3 receptors indicates an increased thrombogenicity which is clinically manifested with an early incidence of acute myocardial infarction. The cytoplasmic β3 subunit of the αIIbβ3 receptor interacts with many signalling and cytoskeletal proteins during integrin activation, including kindlin-3. Any loss of the β3 interactions with the adaptor protein kindlin-3 can lead to a defective signalling and subsequently impaired platelet function. The aim of the present study was to investigate the potential of mimetic peptides and their influence on the role of kindlin-3 in the signalling cascade. Studies on human platelets were performed to evaluate the static adhesion to fibrinogen and fibronectin. One focus was placed on evaluating the two gene variants of the HPA-1 polymorphism. Initially, a protocol was developed for the use of β3 mimetic peptides for the binding site of kindlin-3 to the β3 subunit of the integrin receptor αIIbβ3. Internalisation of the peptides was confirmed by means of laser microscope after FIAsH labelling. On this basis, the suitable concentrations and incubation conditions were determined for both gene variants in a series of tests using aggregometry and fluoroscan. After implementation of the protocol, the effect of β3 mimetic peptides on the static adhesion behaviour to fibrinogen and fibronectin was analysed in a further step by means of quantitative fluorescence measurement (n=25) and laser microscopy using platelets from donor blood of homozygous carriers of HPA 1a/1a or HPA 1b/1b, respectively. Regarding the general use of mimetic peptides, the results show that peptides are able to overcome the complex membrane barrier of the platelets and also have a different specific influence on the platelet adhesion and aggregation of both gene variants. In the HPA 1a/1a variant, a significant inhibitory effect on platelet adhesion was demonstrated after application of β3 mimetic peptides for the binding site of kindlin-3 implying the possibility of pharmacological therapies after further pursuing these research activities. In contrast, platelets of the HPA 1b/1b variant showed a significant inverse reaction, i.e. increased static adhesion to both ligands fibronectin by 30% and fibrinogen by 56%, respectively; this effect was unexpected, as it has not yet been described in scientific literature. Aggregometry tests performed within the scope of the development of the protocol confirm this trend. Platelets of the HPA-1b variant consistently demonstrated a higher adhesion potential to fibrinogen. In our experimental design, the inhibitory effect of β3 mimetic peptides on platelets of the HPA-1a variant was equivalent for both ligands with a reduction of the static adhesion of -22%. In conclusion, kindlin-3 seems to 1.) have an adhesion-limiting effect in the signalling cascade of the αIIbβ3 integrin activation and 2.) play a polymorphism-specific role. This results in new hypotheses that will be discussed in the present study. Due to the successful initial use of β3 mimetic peptides for the binding site of kindlin-3, further (e.g. rheological) analyses appear promising with regard to a potential future pharmacotherapy. Moreover, a more accurate comparison of both gene variants is required for the assessment of the pharmacological safety profile. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Hämostaseologie und Transfusionsmedizin | |||||||
| Dokument erstellt am: | 04.12.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 04.12.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 26.02.2019 | |||||||
| Datum der Promotion: | 03.12.2019 |
