Dokument: Role of Sas-4/CPAP in building functional centrosomes and cilia

Titel:	Role of Sas-4/CPAP in building functional centrosomes and cilia
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=51586
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20191120-130759-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Ramani, Anand [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 25,76 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.11.2019 / geändert 19.11.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Gopalakrishnan, Jay [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr Klein, Thomas [Betreuer/Doktorvater]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das konservierte Centrosomal-P4.1-assoziierte Protein (CPAP) und sein Fliegenortholog Sas-4 sind seit langem als bloße Zentriol-Duplikationsfaktoren bekannt. Trotz seiner Rolle beim Aufbau von PCM-Komplexen blieb seine spezifische Funktion beim Aufbau funktionaler Zentrosomen umstritten. Hier in dieser Studie zeige ich, dass sowohl CPAP als auch Sas-4 eine herausragende Rolle beim Aufbau funktionaler Zentrosomen spielen. Die in dieser Studie erreichte Kristallstruktur des CPAP PN2-3-Tubulinkomplexes hat die Rätsel gelöst, die den Einbau von Tubulindimeren in wachsende zentriolare Mikrotubuli ausschließen. Die Ergebnisse in dieser Arbeit veranschaulichen, wie CPAP sein an der Zentriolenstelle gebundenes Tubulin in kontrollierter Weise über einen kupplungsartigen Mechanismus bindet und frei gibt. Es wurde gezeigt, dass die C-terminale PN2-3-Region von CPAP an eine saure Mikrotubuli-Außenfläche von β-Tubulin bindet; wohingegen die N-terminale Schleifenhelix eine Kette bildet, die an die α-β-Interphase von β-Tubulin bindet, wodurch die Bindung des nächsten α-β-Tubulindimers blockiert wird. CPAP bindet an Tubulindimere mit hoher Affinität über seinen F375-Rest am C-Terminus der PN2-3-Domäne. Diese hohe Affinität hemmt die spontane Polymerisation von Tubulindimeren. Wie genau das gebundene Tubulin an den zentriolaren Mikrotubuli freigesetzt wird, ist nicht eindeutig geklärt. Es ist jedoch möglich, dass das gebundene Tubulin zu den Zentriolen gebracht wird, wo CPAP über seine Mikrotubuli-bindende Domäne (MBD) an die Zentriolar-Mikrotubuli bindet. Die Tubulindimere werden dann durch eine Verringerung der Affinität an der EE343-Stelle am N-Terminus der PN2-3-Region freigesetzt. Diese verminderte Affinität könnte ein Ergebnis einer posttranslationalen Modifikation sein, die in CPAP während der Zentriol-Elongation auftritt. Dies liegt daran, dass CPAPEE343RR oder Sas-4EE78RR, welche die Bindungsstelle für mehr Tubulindimere freisetzen, tatsächlich verlängerte Zentriolen und ein verlängertes Cilium zeigen. Nach der Entschlüsselung der Rolle von CPAP/Sas-4 bei der Zentriol-Elongation versuchte ich, die Rolle von Sas-4 bei der Rekrutierung von Pericentriolarmaterial (PCM) zu entschlüsseln. In der vorherigen Studie von Gopalakrishnan et al. wurde gefunden, dass Sas-4 ein Gerüst für mehrere PCM-Proteine ist, einschließlich der Komponenten, welche das PCM bei Mitose ausdehnen. Dies wurde durch eine Studie in C. elegans bestätigt, in der die PCM-Größe durch die Menge an Sas-4 reguliert wurde. Daher vermutete ich, dass Sas-4 eine Rolle bei der PCM-Expandierung und der Reifung von Zentrosomen spielt. Diese Studie identifizierte zwei verschiedene monoklonale Anti-Sas-4-Antikörper. Einer der Antikörper erkennt Sas-4 in allen Stadien des Zellzyklus; während der zweite Antikörper Sas-4 nur in der Interphase und nicht in der Mitose erkennt. Daher untersuchte ich, ob Sas- 4 zu Beginn der Mitose an diesem Epitop modifiziert wurde. Biochemische Untersuchungen sowie Immunfluoreszenzanalysen von mutierten Sas-4-Proteinen und -Peptiden zeigen, dass die TT211-Stelle von Sas-4 zu Beginn der Mitose phosphoryliert wird. Ein in vitro Kinase-Assay identifiziert Plk1/Polo als verantwortliche Kinase, die Sas-4 an der TT211- Stelle zu Beginn der Mitose phosphoryliert. Die Verwendung von BI2536, einem Inhibitor für Plk1/Polo, bestätigt dies, da die Phosphorylierung inhibiert wurde. Die funktionelle Bedeutung dieser Phosphorylierung wird in vivo untersucht, indem Drosophila verschiedene Sas-4-Mutanten exprimiert. Fliegen, welche die Sas-4TT211AA-Mutation exprimierten, zeigten eine verringerte Rekrutierung von PCM-Proteinen wie Cnn und γ-Tubulin. Dies bestätigte tatsächlich, dass Sas-4 für die Expandierung von PCM während der Mitose erforderlich ist. Zusammenfassend haben meine Experimente die Rolle von Sas-4, das bisher nur als Zentriolen-Duplikationsfaktor bekannt war, überarbeitet und den Mechanismus aufgedeckt, durch den CPAP/Sas-4 die Zentriolen- und Cilium-Länge und die Rekrutierung von PCM in mitotischen Zentrosomen reguliert. Diese beiden Aspekte sind der grundlegende Prozess zum Aufbau funktionaler Zentrosomen in tierischen Zellen. The conserved centrosomal-P4.1-associated protein (CPAP) and its fly ortholog Sas-4 have long been known as mere centriole duplication factors. Despite its role in assembling PCM complexes, its specific function in building functional centrosomes remained controversial. Here, in this study, I demonstrate that both CPAP and Sas-4 have a prominent role in building functional centrosomes. The crystal structure of CPAP PN2-3- tubulin complex achieved in this study has unraveled the mysteries that precluded the incorporation of tubulin dimers into growing centriolar microtubules. The work in this thesis sheds light on how CPAP binds and releases its bound tubulin at the site of centrioles in a controlled manner via a clutch like mechanism. The C-terminal PN2-3 region of CPAP is found to bind to an acidic microtubule outer surface of β-Tubulin; whereas, the N-terminal loop helix forms a necklace that binds to the α-β interphase of β-Tubulin, thereby blocking the binding of the next α-β Tubulin dimer. CPAP binds to tubulin dimers with high affinity via its F375 residue located at Cterminal of the PN2-3 domain. This high affinity inhibits the spontaneous polymerization of tubulin dimers. How the bound tubulin is exactly released at the centriolar microtubules is not well understood; however, it is possible that the bound tubulin is taken to the centrioles, where CPAP binds to the centriolar microtubules via its microtubule binding domain (MBD). The tubulin dimers are then released by a reduction in the affinity at the EE343 site located at the N-terminal of the PN2-3 region. This reduced affinity could be a result of posttranslational modification occurring in CPAP during centriole elongation. This is because, CPAPEE343RR or Sas-4EE78RR, which uncap the binding site for more tubulin dimers, indeed show elongated centrioles and cilium. After deciphering the role of CPAP/Sas-4 in centriolar elongation, I aimed to decipher the role of Sas-4 in pericentriolar material (PCM) recruitment. In the previous study by Gopalakrishnan et al., Sas-4 was found to be a scaffold for several PCM proteins, including the bona-fide components that expand the PCM at mitosis. This was re-affirmed by a study in C. elegans, wherein the PCM size was regulated by the amount of Sas-4. Therefore, I speculated Sas-4’s role in PCM expansion and centrosome maturation. This study identified two different monoclonal anti-Sas-4 antibodies. One of the antibodies recognizes Sas-4 at all stages of the cell cycle; whereas the second recognizes Sas-4 only at interphase and not at mitosis. Therefore, I proposed that Sas-4 might be modified at this epitope at the onset of mitosis. Biochemical studies of mutant Sas-4 proteins and peptides coupled with immunofluorescence analysis show that the TT211 site of Sas-4 is phosphorylated at the onset of mitosis. In vitro kinase assay identifies Plk1/Polo to be the responsible kinase phosphorylating Sas-4 at the TT211 site, at the onset of mitosis. This is confirmed using BI2536, an inhibitor for Plk1/Polo, which did inhibit the phosphorylation. The functional significance of this phosphorylation is studied in vivo using Drosophila expressing different Sas-4 mutants. Flies expressing the Sas-4TT211AA mutation show reduced recruitment of bona-fide PCM proteins such as Cnn and γ-Tubulin. This indeed confirms that Sas-4 is required for expanding PCM at mitosis. In summary, my experiments have revisited the role of Sas-4, which was only known to be a centriole duplication factor and uncovered the mechanism by which CPAP/Sas-4 regulates centriole/ cilium length and PCM recruitment in mitotic centrosomes. These two aspects are the fundamental process of building functional centrosomes in animal cells.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Humangenetik und Anthropologie
Dokument erstellt am:	20.11.2019
Dateien geändert am:	20.11.2019
Promotionsantrag am:	01.03.2019
Datum der Promotion:	03.07.2019