Dokument: Molecular and functional analyses of mutant Idh1 in murine neural stem and progenitor cells
| Titel: | Molecular and functional analyses of mutant Idh1 in murine neural stem and progenitor cells | |||||||
| Weiterer Titel: | Molekulare und funktionelle Analysen der Idh1 Mutation in murinen neuralen Stamm- und Progenitorzellen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=51368 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20191030-110738-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Knühmann, Miriam [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Guido Reifenberger [Gutachter] Prof. Dr. Weber, Andreas [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Idh1, Idh1 mutation, Glioma, Neural stem cells, NSC | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Mutationen des Isozitratdehydrogenase 1 (IDH1)-Gens finden sich in etwa 70 % der diffusen und anaplastischen Gliome der World Health Organization (WHO)-Grade II und III. Die eingehende Charakterisierung der funktionellen Bedeutung dieser Mutationen ist durch die eingeschränkte Verfügbarkeit geeigneter Zellmodelle, welche die Pathophysiologie IDH1-mutanter Gliomzellen widerspiegeln, erschwert. In dieser Doktorarbeit wurde ein konditionelles knock-in Mausmodell untersucht, welches auf der heterozygoten Expression eines mutanten Idh1-Allels unter dem endogenen Promotor in nicht-immortalisierten neuralen Stamm- und Progenitorzellen (NSZ/NPZ) basiert. Im Gegensatz zu transfizierten und überexprimierenden IDH1-mutanten menschlichen Glioblastomzelllinien weisen induzierbare Idh1-mutante murine NSZ/NPZ keinen neoplastischen Mutationshintergrund auf, wodurch die alleinige Charakterisierung der Idh1-Mutation möglich ist und eine frühe Phase der Gliomentstehung modelliert werden kann.
In den eigenen Untersuchungen stellte sich allerdings heraus, dass einige Faktoren die Verwendung des auf einem durch 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)-induzierbaren CreERtam/loxp Rekombinase-System basierenden knock-in Modells limitierten. Neben 4-OHT-vermittelter Zytotoxizität für NSZ/NPZ wurden eine geringe Rekombinationseffizienz sowie ein Proliferationsnachteil rekombinanter Zellen und damit das Verschwinden der Idh1-mutanten Zellen aus der kultivierten Zellpopulation über die Zeit festgestellt. Potentielle Mechanismen der Zytotoxizität von 4-OHT wurden in der vorliegenden Arbeit untersucht, jedoch gelang es nicht diese vollständig zu umgehen. Aufgrund des Verschwindens Idh1-mutanter Zellen aus den kultivierten NSZ/NPZ-Populationen über die Zeit konnten weiterhin nur akute Effekte der Idh1-Mutation erfasst werden. Ausgeprägte Unterschiede zwischen einzelnen NSZ/NPZ-Kulturen und Experimenten können auf interindividuelle Unterschiede sowie unterschiedliche Anteile rekombinanter Zellen in den jeweilig untersuchten Populationen zurückgehen. Trotz dieser experimentellen Limitationen konnten durch RNA-Sequenzierung der konditionellen Idh1-mutanten knock-in NSZ/NPZ im Vergleich zu Idh1-Wildtyp NSZ/NPZ Unterschiede auf Transkriptebene identifiziert werden. Unter anderem wurde in Idh1-mutanten Zellen die Expression von Hmox1 induziert. Eine vestärkte Expression von HMOX1 wurde bereits für humane Gliome beschrieben und mit vermindertem Ansprechen auf eine Chemotherapie in Verbindung gebracht. Die von der Idh1-Mutation abhängige Induktion der Hmox1-Expression wurde auf Transkript- und Proteinebene in 2-HG behandelten NSZ/NPZ verifiziert, um Nebeneffekte des konditionellen knock-in Modells als Auslöser auszuschließen. Als potenzielle Ursachen der Hmox1-Induktion in NSZ/NPZ durch 2-HG wurden erhöhte ROS-Level, eine induzierte integrierte Stressantwort, die Aktivierung des p38-Signalweges und eine Induktion der Cdkn1a-Transkription nachgewiesen. Das konditionelle knock-in Mausmodell für mutantes Idh1 konnte somit in dieser Arbeit trotz verschiedener Limitationen erfolgreich für die molekulare und funktionelle Charakterisierung möglicher Effekte einer Idh1-Mutation in murinen NSZ/NPZ-Kurzzeitkulturen eingesetzt werden. Weitergehende Untersuchungen sind notwendig, um die Mechanismen der Idh1-abhängigen Gliomentstehung und der möglichen Rolle von Hmox1 bei diesem bislang erst ansatzweise verstandenen Prozess besser zu verstehen.Mutations of the isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) gene are found in approximately 70 % of the diffuse and anaplastic gliomas of World Health Organization (WHO) grades II and III. The in-depth characterization of the functional importance of these mutations is hampered by the limited availability of suitable cell models reflecting the pathophysiology of IDH1-mutant glioma cells. In this doctoral thesis, a conditional knock-in mouse model was investigated that is based on the heterozygous expression of a mutant Idh1-allele under the endogenous promoter in non-immortalized neural stem and progenitor cells (NSC/NPCs). In contrast to transfected and overexpressing IDH1-mutant human glioblastoma cell lines, inducible Idh1-mutant murine NSC/NPCs have no neoplastic mutation background, allowing for the specific characterization of the Idh1 mutation and thus modeling an early phase of glioma formation. Own investigations, however, revealed that several factors limited the use of the knock-in model based on a 4-hydroxytamoxifen (4-OHT)-inducible CreERtam/loxP recombinase system. In addition to 4-OHT-mediated cytotoxicity for NSC/NPCs, a low recombination efficiency was found. Moreover, recombinant cells demonstrated a proliferation disadvantage and hence vanished from the cultured cell population over time. Potential mechanisms of cytotoxicity of 4-OHT were investigated in the present work and attempts were made to circumvent them experimentally. However, this was not completely successful. Due to the disappearance of Idh1-mutant cells from the cultured NSC/NPC populations over time, only acute effects of the Idh1 mutation could be experimentally assessed. Variabilities of experimental findings detected between individual NSC/NPC cultures were likely due to interindividual differences of the investigated cultures as well as differences in the proportion of recombinant cells in the cell populations studied. Despite these experimental limitations, RNA sequencing of conditional Idh1-mutant knock-in NSC/NPC cultures succeeded in identifying differences at the transcript level compared to their Idh1-wildtype counterparts. For example, expression of Hmox1 was found to be induced in Idh1-mutant cells. Enhanced expression of HMOX1 has been previously reported for human gliomas and associated with decreased response to chemotherapy. The Idh1 mutation-dependent induction of Hmox1 expression was verified by targeted analyses at the transcript and protein levels in 2-hydroxyglutarate (2-HG)-treated NSC/NPC cultures to exclude unspecific effects of the conditional knock-in model. As potential causes of Hmox1 induction in NSC/NPC by 2-HG, increased ROS levels, an induced integrated stress response, activation of the p38 signaling pathway, and induction of Cdkn1a transcription were observed. In spite of several limitations, the conditional knock-in mouse model for mutant Idh1 was successfully employed for the molecular and functional characterization of possible effects of Idh1 mutation in murine NSC/NPC short-term cultures. Further investigations are needed to better understand the mechanisms of Idh1-dependent glioma formation and the possible role of Hmox1 in this complex process, which remains only been partially understood to date. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 30.10.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 30.10.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 30.04.2019 | |||||||
| Datum der Promotion: | 05.07.2019 |
