Dokument: Role of ammonia in mitochondrial function, morphology and metabolism: implications for the pathogenesis of hepatic encephalopathy

Titel:	Role of ammonia in mitochondrial function, morphology and metabolism: implications for the pathogenesis of hepatic encephalopathy
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=51312
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20191021-095632-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Drews, Leonie [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,41 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.10.2019 / geändert 18.10.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Reichert, Andreas [Gutachter] Prof. Dr. Klöcker, Nikolaj [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Hepatic encephalopathy (HE) is a common neurological complication in patients with severe liver disease or portosystemic shunt. An estimated 50-70% of cirrhosis patients develop HE. Besides decades of research the pathological mechanisms behind HE remain largely unknown and symptomatic treatment options are mainly based on empirical observations. Symptoms can be mild to severe, ranging from personality changes, impaired intellect, disturbed sleeping and depressed level of consciousness to hepatic coma and death. HE with liver cirrhosis has a very poor prognostic and, without liver transplantation, which remains the only curative approach, the one-year survival rate is only 42% after the first episode of HE. There are many hypotheses on the pathogenesis of HE, but it is widely accepted that ammonia is the primarily responsible neurotoxin. Ammonia is produced mainly in the gastrointestinal tract and accumulates in the blood stream when not removed by an insufficient liver. It can pass the blood brain barrier, enter the astrocytes, which are known to be the primarily affected brain cells, and cause neurological dysfunctions. Additionally, some studies attribute a role to an increase in ROS through ammonia exposure, as well as to autophagy as a potential target of ammonia. There is some evidence of a mitochondrial contribution to HE pathogenesis, e.g. changes in mitochondrial dynamics and a decrease in enzyme activity in the respiratory chain complexes. However, the exact mechanisms, especially regarding rapid effects of ammonia and influences on energy metabolism, remain unclear. To gain a thorough mechanistic insight on the role of mitochondrial energy metabolism in the early stages of HE, I employed an HE model based on human astrocytoma cells and rat-derived primary astrocytes to explore morphological and bioenergetic changes. In the investigated models hyperammonemia induced mitochondrial fragmentation within hours and compromised mitochondrial respiration and glycolysis within minutes. The effect was rapid, independent of possible pH changes mediated by NH4Cl and strongly dose dependent, which is in line with most patient data showing an increase in disease severity proportional to blood or cerebrospinal fluid ammonia levels. Mitochondrial fragmentation as well as decrease in respiration were quickly reversible upon ammonia removal. Further, a directed metabolomics approach showed an accumulation of glucose and nearly all investigated amino acids. Isotope labeling of NH4Cl confirmed the incorporation of ammonia-derived nitrogen mainly into glutamate, aspartate, proline and the branched-chain amino acids; amino acids primarily or secondarily derived from the glutamate dehydrogenase (GDH). GDH2, a purely mitochondrial GDH isozyme that has evolved in great apes and humans, typically catalyzes the reaction from glutamate to α ketoglutarate to feed the TCA cycle. However, targeting GDH2 with RNA interference and negative regulation by SIRT4 as well as anaplerotic supplementation of glutamate and glutamine rescued the ammonia-induced impact on respiration. Overall, I propose a new mechanism in HE pathogenesis where the ammonia detoxifying GDH reaction in hyperammonemia reduces α ketoglutarate levels, thereby driving a truncation of the TCA cycle and impairing mitochondrial respiration. This suggest that hyperammonemia reverses the direction of the GDH2 reaction. Furthermore, my results together with other results obtained by the group suggest a role of autophagy in HE pathogenesis. Glucose starvation, possibly inducing autophagy, and driving autophagy by nanoparticle pretreatment alleviated the ammonia-induced effect on respiration. Hence, manipulation of autophagy, GDH2 activity or the cell energy metabolism as a whole are promising new targets for the development of novel HE treatment strategies. Hepatische Enzephalopathie (HE) ist eine häufige neurologische Komplikation von Patienten mit einer schweren Leberdysfunktion oder einer portosystemischen Gefäßverbindung (Lebershunt). Geschätzte 50-70 % der Zirrhosepatienten entwickeln HE. Trotz jahrzehntelanger Forschung ist der pathologische Mechanismus von HE noch immer weitestgehend unverstanden und die symptomatischen Behandlungsoptionen basieren größtenteils auf empirischen Beobachtungen. Symptome von HE rangieren von leicht bis schwer und zeichnen sich durch Veränderungen der Persönlichkeit, beeinträchtigten Intellekt, Schlafstörungen und einen verminderten Bewusstseinszustand aus, bis hin zu hepatischem Koma und Tod. HE ausgelöst durch Leberzirrhose hat eine sehr schlechte Prognose mit einer 1-Jahr-Überlebensrate von nur 42 % nach dem ersten Auftreten von HE, ohne Lebertransplantation, welches noch immer die einzige Heilungschance bietet. Es gibt viele Hypothesen, die die Pathogenese von HE zu erklären versuchen, doch die am meisten akzeptierte benennt Ammoniak als das hauptverantwortliche Neurotoxin. Ammoniak wird hauptsächlich im Gastrointestinaltrakt produziert und reichert sich im Blut an, wenn es nicht durch die geschädigte Leber abgebaut werden kann. Der Stoff kann die Blut-Hirn-Schranke überqueren, wo er sich in den Astrozyten anreichern und neurologische Störungen auslösen kann. Astrozyten sind diejenigen Gehirnzellen welche im Wesentlichen von Ammoniak beeinträchtigt werden. Zudem werden die Erhöhung von ROS sowie Autophagie als potenzielle Angriffspunkte von Hyperammonämie diskutiert. Es gibt Hinweise auf eine Beteiligung der Mitochondrien an der HE Pathogenese, gezeigt wurden beispielsweise Veränderungen in der mitochondrialen Dynamik und eine Verringerung von Enzymaktivitäten in der Atmungskette. Dennoch sind die genauen Mechanismen, insbesondere in Bezug auf rapide Ammoniakeffekte sowie einen möglichen Einfluss auf den Energiemetabolismus, noch weitestgehend unverstanden. Um mechanistische Erkenntnisse über die Rolle des mitochondrialen Energiemetabolismus in der frühen Pathogenese von HE zu erlangen arbeitete ich mit zellbasierten HE Modellen, zum einen mit humanen Astrozytoma Zellen, zum anderen mit primären Astrozyten der Ratte. Diese dienten der Untersuchung von morphologischen und bioenergetischen Veränderungen auf Grund von Hyperammonämie. In den untersuchten Modellen hat eine erhöhte Ammoniakexposition innerhalb weniger Stunden mitochondriale Fragmentierung sowie innerhalb von Minuten eine starke Verminderung von mitochondrialer Atmung und Glykolyse ausgelöst. Dieser Effekt war schnell, unabhängig von möglichen NH4Cl bedingten pH Änderungen und stark dosisabhängig, was Erkenntnisse aus Patientendaten wiederspiegelt, wonach die Schwere der Erkrankung meist proportional zur Höhe der Ammoniakwerte in Blut und Rückenmarksflüssigkeit ist. Die mitochondriale Fragmentierung sowie die Verminderung der Atmung waren schnell reversibel, sobald die Ammoniakexposition beendet wurde. Des Weiteren zeigte ein zielgerichteter Metabolomikversuch die Anreicherung von Glukose und fast allen untersuchten Aminosäuren in den Zellen. Isotopenmarkierung von NH4Cl untermauerte die Aufnahme von Stickstoff aus Ammoniak hauptsächlich in Glutamat, Aspartat, Prolin und den verzweigtkettigen Aminosäuren; alles Aminosäuren welche primär oder sekundär über Glutamat Dehydrogenase (GDH) synthetisiert werden. GDH2, ein rein mitochondriales GDH Isozym, welches in Menschenaffen und Menschen evolviert ist, katalysiert normalerweise die Reaktion von Glutamat zu α Ketoglutarat zur Anaplerose des TCA Zyklus. Der knock-down von GDH2 via RNA Interferenz sowie die negative Regulierung dessen Aktivität durch SIRT4 und die anaplerotische Supplementierung von Glutamat und Glutamin hob den negativen Effekt von Ammoniak auf die mitochondriale Atmung auf. Als Ergebnis dieser Arbeit schlage ich einen neuen Mechanismus der HE Pathogenese vor, in welchem die Ammoniak detoxifizierende GDH Reaktion zu einer Verringerung von α Ketoglutarat führt. Dies wiederum löst eine Störung des TCA Zyklus aus und führt so zur Reduzierung der mitochondrialen Atmung. Dies zeigt, dass Hyperammonämie zu einer Umkehrung der GDH2 Reaktion führt. Ferner deuten meine Daten, zusammen mit anderen Arbeiten der Gruppe, auf eine Rolle der Autophagie hin. Glukose Limitierung, welche möglicherweise Autophagie induziert, sowie Vorbehandlung mit Autophagie treibenden Nanopartikeln vor der Zugabe von Ammoniak kann den negativen Effekt auf die Atmung verhindern. Somit sind Veränderungen an Stellschrauben der Autophagie, der GDH2 Aktivität sowie am zellulären Energiemetabolismus im Ganzen vielversprechende neue Ziele für die Entwicklung von neuartigen Behandlungsmöglichkeiten der HE.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie I
Dokument erstellt am:	21.10.2019
Dateien geändert am:	21.10.2019
Promotionsantrag am:	24.06.2019
Datum der Promotion:	09.10.2019