Dokument: Investigation on translocation and proteolytic processing of the lanthipeptide nisin

Titel:	Investigation on translocation and proteolytic processing of the lanthipeptide nisin
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=51271
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20191017-102513-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Lagedroste, Marcel [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 70,87 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 15.10.2019 / geändert 15.10.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Lanthipeptide sind ribosomal synthetisierte und posttranslational modifizierte Peptide, die ungewöhnliche Aminosäuren wie Dehydroalanin, Didehydrobutyrin sowie (Methyl-) Lanthionin enthalten. Eines der am besten untersuchten und als Modelsystem genutzten Lanthipeptide, ist das vom Gram-positiven Bakterium Lactococcus lactis produzierte Nisin. Es wird als Vorläuferpeptid (NisA), bestehend aus einem N-terminalen Signalpeptid und einem C-terminalen Kernpeptid, synthetisiert. Innerhalb des Kernpeptids werden durch die Dehydratase NisB und die Zyklase NisC die posttranslationalen Modifikationen eingebaut, wobei das Signalpeptid als Enzymerkennungsstelle fungiert. Darüber hinaus wird das Signalpeptid vom „ATP-binding cassette“ (ABC) Transporter NisT erkannt, der NisA über die Zytoplasmamembran transportiert. Anschließend wird das Signalpeptid von einer extrazellulären Serinprotease NisP entfernt und das reife, antimikrobiell aktive Nisin freigesetzt. In der vorliegenden Dissertation wird die Translokalisierung von NisA mittels der in vivo und in vitro Charakterisierung von NisT untersucht. Dabei wurden Experimente zur Bestimmung der in vitro ATPase Aktivität von Detergens solubilisierten und gereinigten NisT mit und ohne Substrat, sowie Interaktionsstudien mit den Interaktionspartnern NisB und NisC durchgeführt. Es wurde ermittelt, dass die basale ATPase Rate nicht durch die Zugabe von verschiedenen Substraten in einer konzentrationsabhängigen Weise stimuliert wurde. Jedoch zeigte die quantitative Analyse eines in vivo Sekretionsexperiments den modulierenden Effekt der Modifikationsmaschine. Dort wurde eine Erhöhung der apparenten Sekretionsrate durch die Modifikationsmaschine beobachtet. Folglich ist der Komplex bestehend aus NisT, NisB und NisC, der bei den Interaktionsstudien beobachtet wurde, unabdingbar für eine effiziente NisA Sekretion. Darüber hinaus wurde das Erkennungsmotiv für NisT im Signalpeptid mittels Mutationsanalyse in Kombination mit einem in vivo Sekretionsexperiment untersucht. Ähnlich zu der Modifikationsmaschine erkennt NisT das FNLD-Box Motiv und zusätzlich geladene Aminosäuren als zweites Erkennungsmotiv. Weiterhin erlaubt die Analyse von erstellten Signalpeptidhybriden eine Schlussfolgerung, wie das Signalpeptid die Substratspezifität von NisT und damit den Transport von NisA beeinflusst. Abschließend behandelt die vorliegenden Dissertation die Reifung von NisA, indem die Signalpeptid Peptidase NisP in vitro charakterisiert wurde. Bei der Untersuchung der kinetischen Parameter von unterschiedlichen Substraten zeigte es sich, dass NisP die höchste katalytische Effizienz für modifiziertes NisA aufweist. Bemerkenswerterweise ist mindestens ein (Methyl-)Lanthioninring für eine effiziente Schneidereaktion des Signalpeptids notwendig. Dies reflektiert die präferierte Substratspezifität von NisP gegenüber (Methyl-)Lanthionin enthaltenden Substraten. Lanthipeptides are ribosomal synthesized and post-translational modified peptides containing unusual amino acids such as dehydroalanine, dehydrobutyrine and (methyl-)lanthionine. One of the best-studied lanthipeptides and used as a model system is nisin, produced by the Gram-positive bacterium Lactococcus lactis. It is synthesized as a precursor peptide (NisA) consisting of an N-terminal leader peptide and a C-terminal core peptide. Within the core peptide the dehydratase NisB and the cyclase NisC introduce the post-translational modifications, where the leader peptide acts as an enzyme recognition site. Furthermore, the leader peptide is a secretion signal for the ATP-binding cassette (ABC) transporter NisT. The exporter translocates NisA in a proposed channelling mechanism across the cytoplasmic membrane. Subsequently, the leader peptide is cleaved off by the extracellular located serine protease NisP and the mature nisin is released. In the present thesis, the translocation of NisA is investigated by an in vitro and in vivo characterization of NisT. In vitro ATPase activity with and without substrate as well as pull-down assays with the interaction partner were performed with detergent-solubilised and purified NisT. It was found, that the basal ATPase rate was not stimulated by various substrates in a concentration-dependent manner. However, a conducted quantitative analysis of an in vivo secretion assay demonstrated the modulation by the modification machinery. Here, a strong enhancement of the apparent secretion rate was observed. Thus, the complex of NisT, NisB and NisC, which was observed by a pull-down assay, is prerequisite for an efficient NisA secretion. Furthermore, the recognition site of the leader peptide for NisT was investigated by mutational analysis in combination with an in vivo secretion assay. Similarly to the modification machinery, NisT recognises the FNLD-box motif and in addition charged residues as a secondary motif. Moreover, the analysis of leader hybrids allowed to conclude, how the leader peptide is influencing the substrate specificity of NisT and thereby the translocation process. Finally, the thesis deals with the NisA maturation by characterising the leader peptidase NisP in vitro. Here, kinetic parameter of various substrates revealed, that NisP has the highest catalytic efficiency for modified NisA. Noteworthy, at least one lanthionine ring is necessary for efficient leader peptide cleavage. This reflects the preferred substrate specificity of NisP towards (methyl-)lanthionine-containing substrates
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	17.10.2019
Dateien geändert am:	17.10.2019
Promotionsantrag am:	01.07.2019
Datum der Promotion:	13.09.2019