Dokument: Development of FRET-based glucose sensors for application in small scale cultivations
| Titel: | Development of FRET-based glucose sensors for application in small scale cultivations | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=51191 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20201110-091425-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Otten, Julia [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Within recent years biotechnology was established as an integral part of the economy. Especially in the context of bioeconomy microbial strain and process development are gaining momentum. Microbial producer strains, converting renewable feedstock into high value compounds, are able to compete with the petrol-based economy. To develop and monitor such strains, metabolite sensors are of great value to understand metabolite dynamics and screen for better producers. One type of such sensors are Förster-Resonance-Energy-Transfer (FRET)-based biosensors.
This type of genetically encoded sensors consist of a metabolite binding domain, sandwiched between two fluorescent proteins. Upon ligand binding the binding domain undergoes a conformational change which results in an altered FRET effect, due to changes in the distance/ orientation of the fluorescent proteins. In this work, a toolbox of FRET-based sensors for the detection and quantification of glucose was constructed and tested for the extracellular application in small scale cultivations. Besides, the molecular function of such sensors was analyzed in cooperation using single molecule fluorescence and small angle X-ray scattering (SAXS). All sensor variants are based on the periplasmic glucose-galactose binding protein from E. coli and carry the cyan fluorescent protein mTurquoise2 as FRET-donor and the yellow fluorescent protein Venus as FRET-acceptor. Important parameters like affinity, sensitivity and stability were optimized by the introduction of different linkers, mutation of the binding protein and by introduction of the HaloTag™ for simple covalent immobilization. A glucose sensor variant with a linker between the binding protein and the FRET-donor resulted in the highest FRET-changes, as a result of large conformational changes between liganded and non-liganded states. This optimized soluble glucose sensor was applied for the at-line analysis of glucose in automated small scale microbial cultivations to demonstrate the potential of such sensors. The sensor performed competitive to established enzymatic and HPLC-based quantification methods for glucose. Further, the application of FRET-based glucose sensors was successfully demonstrated in microbial cultivations using a BioLector® devise. Immobilization of the optimized sensor was shown to increase the stability and resulted in an immobilized glucose sensors, which could successfully be used online in a microtiter-based cultivation. After successful application in the milliliter-scale the immobilized sensor was also evaluated in a microfluidic, chip-based cultivation device at picoliter-scale. Using fluorescence microscopy the sensor, immobilized on beads, reliably indicated changes in glucose concentration thus demonstrating that FRET-based sensor beads are a promising tool also for an application in picoliter-scale bioreactors. This development paves the way for in chip-online-analysis of various metabolites in single cell studies, which is currently not possible.In den letzten Jahren wurde die Biotechnologie zu einem festen Bestandteil der Wirtschaft. Insbesondere im Kontext der Bioökonomie gewinnen Stamm- und Prozessentwicklung immer weiter an Bedeutung. Mikrobielle Produzenten, die nachwachsende Rohstoffe zu hochwertigen Feinchemikalien umwandeln, können mit der ölbasierten Wirtschaft mithalten. Für die Entwicklung und Analyse solcher Stämme, sind Metabolitsensoren von großem Wert um Stoffwechselwege zu verstehen und nach besseren Produzenten zu suchen. Eine Klasse solcher Sensoren sind Förster-Resonanz-Energietransfer (FRET) -basierte Biosensoren. Diese genetisch codierten Sensoren setzen sich aus einer Metabolit-Bindedomäne, zwischen zwei fluoreszierenden Proteinen, zusammen. Eine durch Ligandenbindung induzierte Konformationsänderung, ruft Abstands- / Orientierungs-änderungen der fluoreszierenden Proteine hervor und führt so zu einem veränderten FRET-Effekt. In dieser Arbeit wurde eine Toolbox von FRET-basierten Sensoren zur extrazellulären Quantifizierung von Glukose, in Kultivierungen im Mili- und Microliter Maßstab, entwickelt und getestet. Außerdem wurden, gemeinsam mit Kooperationspartnern, die molekularen Hintergründe solcher Sensoren mit Einzelmolekülfluoreszenzmessungen und Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS) analysiert. Alle Sensorvarianten basieren auf dem periplasmatischen Glucose-Galaktose-Bindeprotein aus E. coli und tragen das cyane Fluoreszenzprotein mTurquoise2 als FRET-Donor und das gelbe Fluoreszenzprotein Venus als FRET-Akzeptor. Wichtige Parameter wie Affinität, Empfindlichkeit und Stabilität wurden durch die Einführung verschiedener Linker, die Mutation des Bindeproteins und durch die Einführung des HaloTag™ zur einfachen kovalenten Immobilisierung optimiert. Eine Sensorvariante mit einem Linker zwischen dem Bindeprotein und FRET-Donor zeigte die höchsten FRET-Änderungen, als Ergebnis großer Konformationsänderungen zwischen gebundenem und ungebundenem Zustand. Dieser optimierte, lösliche Glukosesensor wurde für die At-Line-Analyse von Glukose in automatisierten mikrobiellen Kultivierungen im kleinen Maßstab eingesetzt, um das Potenzial solcher Sensoren zu demonstrieren. Im Vergleich zu etablierten enzymatischen und HPLC-basierten Quantifizierungsmethoden für Glukose, konnte der Sensor überzeugen. Es wurde gezeigt, dass die Immobilisierung des optimierten Sensors die Stabilität erhöht und zu immobilisierten Glukosesensoren führte, die online erfolgreich in einer Kultivierung in Mikrotiterplatten in einem BioLector® eingesetzt werden konnten. Nach erfolgreicher Anwendung im Milliliter Maßstab wurde der immobilisierte Sensor auch in einer Chip-basierten, mikrofluidischen Kultivierung im Pikolitermaßstab bewertet. In der Fluoreszenzmikroskopie zeigte der immobilisierte Sensor zuverlässig Änderungen der Glukosekonzentration an und demonstriert damit, dass FRET-basierte Sensoren auch für eine Anwendung in Bioreaktoren im Pikolitermaßstab ein vielversprechendes Werkzeug sind. Diese Entwicklung ebnet den Weg für die Online-Analyse verschiedener Metaboliten in Einzelzellstudien, was derzeit nicht möglich ist. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 10.11.2020 | |||||||
| Dateien geändert am: | 10.11.2020 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 18.01.2019 | |||||||
| Datum der Promotion: | 08.04.2019 |
