Dokument: Funktionelle Untersuchung der Orexin-Rezeptoren 1 und 2 auf humanen hämatopoetischen CD34+ Stamm- und Vorläuferzellen

Titel:	Funktionelle Untersuchung der Orexin-Rezeptoren 1 und 2 auf humanen hämatopoetischen CD34+ Stamm- und Vorläuferzellen
Weiterer Titel:	Functional analysis of the orexin receptors 1 and 2 in human hematopoietic CD34+ stem and progenitor cells
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=5110
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20070709-095938-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Bork, Simone [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,21 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.07.2007 / geändert 08.07.2007
Beitragende:	PD Dr. Kronenwett, Ralf [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter]
Stichwörter:	Orexin-Rezeptoren / CD34 / Stamm- und Vorläuferzellen
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Einleitung: Durch Genexpressionsanalysen entdeckte unsere Arbeitsgruppe, dass humane hämatopoetische CD34+ Stamm- und Vorläuferzellen eine Reihe von neurobiologisch relevanten Genen exprimieren, darunter auch die G-Protein-gekoppelten Orexin-Rezeptoren 1 und 2 (Steidl et al., 2004). Aufbauend auf diese Beobachtung war es das Ziel dieser Arbeit, die funktionelle Bedeutung der Orexin-Rezeptoren 1 und 2 in hämatopoetischen CD34+ Stamm- und Vorläuferzellen zu analysieren. Methoden: Zur Untersuchung der funktionellen Aktivität der Orexin-Rezeptoren 1 und 2 in hämatopoetischen Zellen wurden immunomagnetisch angereicherte CD34+ Zellen aus peripherem Blut von G-CSF-mobilisierten gesunden Spendern mit den spezifischen Rezeptorliganden Orexin A oder Orexin B alleine oder in Kombination mit dem Orexin-Rezeptor-1-spezifischen Antagonisten SB-334867 stimuliert und anschließend die Effekte auf zellulärer und molekularer Ebene untersucht. Zudem analysierten wir anhand von Affymetrix-Microarrays das Expressionsmuster von insgesamt 8.746 Genen in CD34+ Zellen nach Orexin-Rezeptor-Stimulation Ergebnisse/Schlussfolgerung: Anhand von Zweifarbenimmunfluoreszenz konnten wir zunächst die Proteinexpression der Orexin-Rezeptoren 1 und 2 auf humanen CD34+ Zellen nachweisen und zeigen, dass die Rezeptoren in frühen unreifen CD34+ Zellen stärker exprimiert werden als in reiferen CD34+ Zellen. Diese Beobachtung weist darauf hin, dass die Orexin-Rezeptoren vermutlich eine funktionelle Rolle in der frühen Entwicklung der CD34+ Stamm- und Vorläuferzellen spielen. Auf intrazellulärer Ebene konnten wir beobachten, dass eine Stimulation mit Orexin A oder Orexin B in CD34+ Zellen zu einer signifikanten Reduktion der intrazellulären „second messenger“ Moleküle cAMP und Calcium führt. Dabei geben unsere Ergebnisse einen Hinweis darauf, dass die Orexin-Rezeptoren 1 und 2 in CD34+ Zellen an verschiedene und mehr als ein G-Protein gekoppelt sind. Wir vermuten, dass der Orexin-Rezeptor 1 seine Effekte über ein Gs-Protein als auch über ein Gq-Protein vermittelt, während der Orexin-Rezeptor 2 ein Gi-Protein aktiviert. Weiterhin zeigen unsere Ergebnisse, dass durch eine Orexin-Stimulation die SDF 1β-induzierte Migration von CD34+ Zellen signifikant reduziert wird, was darauf hinweist, dass die Orexin-Rezeptoren an der Regulation der Stammzellmigration beteiligt sind. Auch das klonogene Wachstum von CD34+ Zellen wird durch Orexin A oder Orexin B reduziert, wobei die BFU-E-Kolonien vermutlich über den Orexin-Rezeptor 1 und die CFU-GM Kolonien über den Rezeptor 2 gehemmt werden. Zudem konnten wir zeigen, dass durch Orexin A-Stimulation einige Gene verstärkt exprimiert werden, die eine Rolle bei der Erhaltung und Selbsterneuerung von hämatopoetischen Stammzellen spielen. Diese Beobachtung weist darauf hin, dass die Orexine regulierend an der Differenzierung von CD34+ Zellen beteiligt sind, wobei möglicherweise die Selbsterneuerung von frühen Stammzellen verstärkt und die Ausdifferenzierung zu determinierteren Vorläuferzellen gehemmt wird. Im Rahmen unserer Genexpressionsanalysen fanden wir durch Orexin B insgesamt 44 Gene signifikant hochreguliert, während nach Stimulation mit Orexin A insgesamt 156 Gene hochreguliert und 5 Gene herunterreguliert waren. Dabei konnten wir beobachten, dass das Orexin-induzierte Genexpressionsmuster mit den Ergebnissen aus den funktionellen Experimenten übereinstimmte. So zeigten sich neben Genen, die eine Rolle bei der Selbsterneuerung und Differenzierung von hämatopoetischen CD34+ Stamm- und Vorläuferzellen spielen, vor allem Gene verstärkt exprimiert, die an der Regulation der intrazellulären Calciumkonzentration beteiligt sind oder einen migrationshemmenden Effekt vermitteln. Zudem fanden wir differentiell exprimierte Gene, die an der Orexin-induzierten Regulation von zellulären Prozessen wie dem Glucose- und Lipidmetabolismus oder der oxidativen Stressantwort beteiligt sind. In diesem Zusammenhang weisen unsere Genexpressionsdaten auch darauf hin, dass der Orexin-Rezeptor 1 seine intrazellulären Effekte über eine transkriptionelle Aktivierung des RAS/p38-MAPK/HIF1A-induzierten Signalwegs vermittelt und dadurch möglicherweise an der Regulation der Hämatopoese beteiligt ist. Insgesamt konnten wir im Rahmen dieser Arbeit erstmals einen funktionellen Zusammenhang zwischen dem orexinergen und hämatopoetischen System zeigen. Dabei bieten unsere Ergebnisse die Grundlage für weiterführende Studien, in denen untersucht werden muss, welchen genauen Einfluss die Orexine und ihre Rezeptoren auf das hämatopoetisches System haben und inwieweit diese Ergebnisse eine klinische Relevanz zeigen. Introduction: Recently, we could show by gene expression analyses that human hematopoietic CD34+ stem and progenitor cells express numerous neurobiological genes, among them the G protein-coupled orexin receptors 1 and 2 (Steidl et al., 2004). With regard to these data the aim of this study was to analyse the functional role of the orexin receptors in hematopoietic CD34+ stem and progenitor cells. Methods: In order to elucidate the functional activity of orexin receptors 1 and 2 in hematopoietic cells we incubated immunomagnetically enriched CD34+ cells from peripheral blood of G-CSF-mobilized healthy donors with the specific orexin receptor ligands orexin A or orexin B or in combination with the selective orexin 1 receptor antagonist SB-334867 and examined the functional effects on cellular and molecular level. Furthermore by using Affymetrix microarrays we analysed the expression profile of 8793 defined genes in CD34+ cells following orexin receptor stimulation Results/Conclusion: Using 2-colour immunofluorescence we could demonstrate orexin receptor 1 and 2 protein expression and found that expression of these receptors is greater among the more immature CD34+ subset in comparison with the lineage determined CD34+ subset. These findings indicate that orexin receptors play a functional role in the early development of CD34+ stem and progenitor cells. Following incubation with orexin A or orexin B we could detect a significant decrease of the intracellular second messengers cAMP and calcium in CD34+ cells. These results strongly suggest that the orexin receptor 1 and 2 in CD34+ cells are coupled to different and more than one G protein. We assume that the orexin receptor 1 mediates its cellular effects by Gs and Gq proteins whereas the receptor 2 can activate Gi proteins. We also found that the migration of CD34+ cells induced by SDF-1β is significantly reduced following stimulation with orexins indicating that orexin receptors are involved in regulation of stem cell migration. Furthermore the clonogenic growth of CD34+ cells is significantly impaired in the presence of orexin A or orexin B with BFU-E colonies probably being decreased by the orexin receptor 1 and CFU-GM colonies by the orexin receptor 2. Moreover, we found that stimulation with orexin A resulted in increased expression of genes related to maintenance and self-renewal of hematopoietic stem cells. These data suggest that orexins are involved in the process of differentiation of CD34+ cells by presumably increasing self-renewal of early stem cells and suppressing differentiation into determined progenitor cells. With regard to our gene expression profiles we found 44 genes significantly up-regulated following incubation with orexin B whereas stimulation with orexin A resulted in 156 significantly up-regulated and 5 significantly down-regulated genes. Thereby we could show that the gene expression pattern induced by orexins was in line with the results of our functional experiments. In addition to genes playing a role in self-renewal and differentiation of hematopoietic stem and progenitor cells we found increased expression of genes that are involved in regulation of intracellular calcium concentration or mediate inhibition of migration. Furthermore we found differentially expressed genes that take part in regulation of cellular processes that are induced by orexins as glucose and lipid metabolism or oxidative stress response. In this regard, our gene expression profiles suggest that the orexin receptor 1 mediates its intracellular effects by transcriptional activation of the RAS/p38-MAPK/HIF1A signalling pathway resulting in a regulation of hematopoiesis by the neuromediator. Finally, in this study we could show for the first time a functional interrelation of the orexinergic and hematopoietic system. Our data provide a basis for further studies examining the detailed impact of the orexins and their receptors on the hematopoietic system and to which extend these results show clinical relevance.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	08.07.2007
Dateien geändert am:	08.07.2007
Promotionsantrag am:	29.05.2007
Datum der Promotion:	03.07.2007