Dokument: Untersuchungen zum Invasionsweg und zum Wirtsspektrum bei freilebenden Amöben: Ein aus vannella sp. isolierter Mikroidien-ähnlicher Endozytobiont als intranukleärer Endoparasit

Titel:	Untersuchungen zum Invasionsweg und zum Wirtsspektrum bei freilebenden Amöben: Ein aus vannella sp. isolierter Mikroidien-ähnlicher Endozytobiont als intranukleärer Endoparasit
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=5109
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20070709-140844-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl.-Biol. Scheid, Patrick [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,93 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.07.2007 / geändert 08.07.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Mehlhorn, Hans-Peter Heinz [Gutachter] PD Dr. Dr. Harder, Achim [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Freilebende Nacktamöben sind ubiqitär in vielen aquatischen Habitaten und feuchten Böden zu finden. Sie sind wesentliche Bestandteile von Biozönosen in verschiedenen Substraten. Insbesondere Biofilme dienen ihnen als Habitate. Neben ihrer Rolle als Krankheitserreger dienen freilebende Amöben häufig als Wirte und Vehikel von intrazellulären Organismen. In der vorliegenden Arbeit wurde ein parasitischer Endozytobiont in Wirtsamöben untersucht, der von Kontaktlinsen und aus dem Auge einer Keratitispatientin isoliert wurde. Es gelang, im Untersuchungsmaterial neben mehreren Vannellenstämmen in diesen auch Endozytobionten nachzuweisen. Es war Aufgabe der vorliegenden Untersuchung, diese von den Vannellen aus Kontaktlinsenbehältern isolierten Endozytobionten hinsichtlich ihres Verhaltens in den Wirtsamöben zu untersuchen. Die Aufnahme in die Wirtsamöben und die Entwicklung der Endozytobionten konnte licht- und elektronenmikroskopisch dokumentiert werden. Die Sporen des Endozytobionten KAun1 wurden ausschließlich nach Adhäsion der Sporen und einer Food-Cup-Bildung durch Phagozytose von den Wirtsamöben (Vannella sp., Stamm VanAun0) aufgenommen. Aktive Penetrationsvorgänge wurden nicht beobachtet. In Nahrungsvakuolen wurden die Sporen ins Zytoplasma der Vannellen transportiert. Normalerweise sind lysosomale Enzyme in der Lage, Makromoleküle durch Hydrolyse abzubauen. Nur spärlich wurden jedoch leere Sporenhüllen („Ghosts“) in Nahrungsvakuolen angetroffen. In der Regel wurden die Sporen jedoch nicht verdaut. Nach Durchbrechen der Kernmembran fand die weitere Entwicklung ausschließlich im Kern der Wirtsamöben statt. Bereits mittels Lichtmikroskopie konnten verschiedene Stadien dargestellt werden, die in der Wirtsamöbe im Zytoplasma, in der Folge aber auch im Kern nachgewiesen wurden. Insbesondere die transmissionselektronenmikroskopischen Untersuchungen belegten sowohl die Morphologie der Endozytobionten als auch die Entwicklung im Wirtsamöbenkern. Während der Differenzierung und dem Wachstum der Parasiten nach erfolgter Merogonie und Sporogonie werden sowohl die Kern- als auch die Zellmembran massiv dilatiert. Der Zyklus beginnt von vorn mit der Ruptur der Wirtsamöbenmembran, wodurch die infektiösen Sporen nach außen gelangen und von weiteren Wirtsamöben phagozytiert werden können. Insbesondere die im Rahmen der elektronenmikroskopischen Untersuchungen erkennbare Morphologie der Organellen führte zur Einordnung in die Gruppe Mikrosporidien-ähnlicher Organismen. Vergleiche der Sporenmorphologie der KAun1-Sporen zeigten, dass keine direkte Zugehörigkeit zu den bekannten bzw. beschriebenen Mikrosporidien vorliegt. Färbemethoden wurden zum Nachweis sowie zur taxonomischen Zuordnung eingesetzt, nachdem Sequenzierungsversuche mit Hilfe von spezifischen Sonden bislang nicht zu aussagekräftigen Ergebnissen führten. Es gelang, die Chitin-haltige Sporenwand durch Calcofluor-Färbung nachzuweisen und damit einen weiteren Hinweis der systematischen Zugehörigkeit zu den Mikrosporidien zu erhalten. Die Gram-Färbung ergab jedoch Hinweise auf gramnegative Organismen, während Mikrosporidien in der Fachliteratur als grampositiv beschrieben sind. Wirtsspektrumsversuche wurden mit FLA aus der umfangreichen Stammsammlung des Labors für Med. Parasitologie der Bundeswehr in Koblenz durchgeführt, um Aussagen zur Wirtsspezifität treffen zu können. Von den potenziell pathogenen FLA wurden sowohl Acanthamoeben als auch Naeglerien im Versuch zur Ermittlung des Wirtsspektrums mit berücksichtigt. In diesen Versuchen ist es gelungen, zwei weitere Vannellenarten zu infizieren, wobei der Entwicklungsgang der Endozytobionten mit dem bei VanAun0 + KAun1 identisch war. Kokultivierungsversuche mit zwei in der Zellkultur üblichen Zelllinien blieben aber erfolglos. Dies deutet auf eine gewisse Wirtsspezifität hin. Versuche zur Tenazität (Dauer der Infektiosität der Sporen) durch Reinfektionsversuche rundeten den Untersuchungsansatz ab. Die Sporen zeigten eine hohe Tenazität im Bezug auf die Dauer ihrer Infektiosität. Eine Beteiligung der Mikrosporidien – ähnlichen Organismen an der Pathogenese der Keratitis erscheint eher unwahrscheinlich, da Pseudomonas aeruginosa in unmittelbar vom Auge der Patientin gewonnenen Abstrichen nachgewiesen wurde und die antbakterielle Therapie in der Folge auch erfolgreich durchgeführt werden konnte. Die angewandten Methoden dienten auch dazu, Aufschluss über die systematische Stellung des Endozytobionten zu erhalten. Trotz der erfolglosen Anwendung molekularbiologischer Methoden sowie eines Gram-negativen Färbeergebnisses konnte die Zuordnung morphologisch als Mikrosporidien –ähnlicher Organismus aufgrund der eindeutigen elektronenmikroskopischen Ergebnisse erfolgen. Die im Rahmen der Färbeversuche erzielten sonstigen Resultate (Ausnahme: Gramfärbung) unterstützen dies weiterhin. KAun mit seinem Wirt ist ein Endozytobiont-Wirt-Modell, das es ermöglicht, Interaktionen von FLA und Endozytobionten – auch weiterhin – zu untersuchen. Free-living amoebae (FLA) occur ubiquitously in many aquatic habitats and humid soils. In addition to their role as pathogens, free-living amoebae are known to serve as natural hosts and vehicles of various intracellular organisms. They form an essential part of biocoenoses in various substrates. Biofilms are their preferred habitats. In the present thesis the development of a parasitic endocytobiont within host amoebae by cocultivating FLA of the genus Vannella (strain VanAun0) with endocytobionts (strain KAun1) recently isolated from the contact lens and the inflamed eye of a female patient with keratitis, was examined. In addition to several Vannella strains, the presence of endocytobionts was demonstrated. The purpose of the present study was to analyze these endocytobionts isolated from the Vannella-stages concerning their behaviour in the host amoebae. It was demonstrated by light and electron microscopy how infection and invasion of an eukaryotic organism occurs and grows in the nucleus of the FLA. Microsporidia as obligate intracellular parasites usually infect their hosts by extrusion of the polar filament and by penetration of the host cell membrane. In contrast, it was shown that the spores of strain KAun1 are taken up by phagocytosis after adhesion of the spores to the cell membrane, followed by a food-cup formation (infective phase). Active penetration processes were not observed. The spores were transported into the cytoplasma of the vannellae via food vacuoles. Usually lysosomal enzymes are capable of hydrolyzing macromolecules, but in the present case the spores were not digested. Phase contrast microscopy revealed early stages of the parasites moving through the cytoplasm into the nucleus of the host amoeba. The endocytobionts even proliferated in the amoeba-nucleus by penetrating the nuclear membrane. Transmissionelectron microscopy showed the polymorphic stages within the karyoplasm. The life cycle of microsporidian-like organisms ended up with a sporogonic phase in which a terminal differentiation took place and numerous spores were released by rupture of the host cell membrane. The spores were the only stages which were able to survive outside the host cell. However, empty spore shells (“ghosts”) were sparsely found in food vacuoles. The examinations with the electron microscope, in particular, revealed both the endocytobionts’ morphology and their development inside the nucleus of the host amoeba. The fast-growing parasites expanded the nuclear membrane during the proliferative phase. During differentiation of the parasites after merogony and sporogony, the nuclear membrane and the the cell membrane of the host amoeba were considerably dilated. With the rupture of the amoeba’s membrane the cycle started from the beginning, since the released infectious spores were phagocytized by other host amoebae. In particular, the morphology of the organelles made visible with the electron microscope finally allowed to classify the endocytobionts as a microsporidan-like organism. Comparisons of the morphology of KAun1 spores with microsporidia showed that there is no direct relationship with other known and/or described microsporida. Staining methods were used for identification as well as for taxonomic classification when sequencing attempts by means of specific probes did not yield relevant results. The chitin-containing spore wall could be visualized by calcofluor staining, thus revealing an additional indication for the relation to the microsporida. With Gram staining, however, a Gram-negative reaction was obtained, whereas microsporidia are described as Gram-positive in the literature. In a host spectrum analysis with numerous FLA strains from the Bundeswehr collection, e.g. Naegleria, Acanthamoeba or Hartmannella, only two further Vannella strains from different sources were identified as suitable hosts for the strain KAun1, with a development being identical with that in VanAun0. These results indicated a certain host specificity. Cocultivation tests with two tissue-cell lines showed no proliferation. Reinfection tests were carried out to determine the tenacity (duration of spore infectivity) and completed the test approach. The spores exhibited a high tenacity with respect to the duration of their infectivity (up to 26 months). The fact that Pseudomonas aeruginosa could be identified in swabs taken directly from the patient’s eye and the fact that the subsequent antbacterial therapy was successful implies that the participation of the microsporidan-like microorganisms in the pathogenesis of the keratitis appears rather improbable. All these methods used were also applied to obtain further information on the systematic position of the endocytobiont. Despite the unsuccessful application of methods used in molecular biology and the Gram-negative staining result, the endocytobionts could be morphologically classified as a microsporidan-like organisms due to the clear electron microscopic results. The results obtained in the framework of the staining tests additionally support these findings. Infection of Vannella sp. with the microsporidian-like organism strain KAun1 is a suitable model for studies of the host-parasite relations of eukaryotic organisms using their hosts as so-called Trojan horses.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Zoomorphologie, Zellbiologie und Parasitologie
Dokument erstellt am:	08.07.2007
Dateien geändert am:	08.07.2007
Promotionsantrag am:	03.05.2007
Datum der Promotion:	03.07.2007