Dokument: Oxidation pflanzlicher Triterpenoide mittels Cytochrom-P450-Monooxygenasen
| Titel: | Oxidation pflanzlicher Triterpenoide mittels Cytochrom-P450-Monooxygenasen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=51084 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20191008-110731-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Kranz-Finger, Sarah [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Cytochrom, P450, CYP71A16, CYP705A12, P450-BM3, CYP102A1, Triterpenoide, Marnerol, Lupeol | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Triterpenoide sind in einer hohen Diversität in der Natur zu finden und weisen eine Reihe interessanter biologischer Eigenschaften auf. Die biotechnologische Herstellung von Triterpenoiden ist von Interesse, da diese aus Pflanzen in oft nur geringen Mengen isoliert werden können. Natürlicherweise werden die ersten oxidativen Funktionalisierungsschritte der Triterpenoid-Grundgerüste durch Cytochrom-P450-Monooxygenasen (P450 oder CYPs) selektiv katalysiert. Im Rahmen dieser Arbeit sollten Triterpenoid-spezifische pflanzliche P450-Monooxygenasen charakterisiert werden. Des Weiteren sollte das Potential bakterieller durch Proteinengineering optimierter P450-Monooxygenasen in der Oxidation pflanzlicher Triterpenoide evaluiert werden.
In dem ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die noch nicht biochemisch charakterisierten P450-Enzyme CYP71A16 und CYP705A12 aus Arabidopsis thaliana in Escherichia coli hergestellt und anschließend charakterisiert. Beide cyp-Gene liegen in einem Operon-artigen Gencluster mit dem Gen der Marneral-Synthase auf dem A. thaliana Genom vor. Von CYP71A16 ist bekannt, dass sie die Triterpenoide Marneral und Marnerol an Position 23 in planta und auch in einem rekombinanten Saccharomyces cerevisiae-Stamm hydroxyliert. In dieser Arbeit konnten N-terminal veränderte Varianten beider P450-Enzyme in hohen Mengen von bis 52 mg/L bzw. 33 mg/L (CYP71A16 bzw. CYP705A12) hergestellt und im Anschluss gereinigt werden. Ein bakterielles Redoxpartnersystem bestehend aus dem Flavodoxin YkuN aus Bacillus subtilis und der Flavodoxin-Reduktase Fpr aus E. coli stellte sich dabei für die in-vitro-Versuche mit CYP71A16 als geeigneter heraus als die Cytochrom-P450-Reduktase ATR2 aus A. thaliana. Für die Oxidation von Marnerol zu 23-Hydroxymarnerol durch CYP71A16 konnte ein KM-Wert von 142 µM und ein Kcat-Wert von 3,9 min-1 bestimmt werden. Darüber hinaus konnten Substratbindespektren aufgenommen und eine Dissoziationskonstante für CYP71A16 von 225 µM ermittelt werden. Mittels GC/MS-Analysen konnte ein bislang noch nicht detektiertes Überoxidationsprodukt von 23-Hydroxymarnerol detektiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte für CY705A12 keine katalytische Aktivität nachgewiesen werden. In Substratbindestudien konnte allerdings ermittelt werden, dass das Diterpenoid Agatholal, das strukturelle Ähnlichkeiten zu Marnerol aufweist, an CYP705A12 bindet. In dem zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Oxidation der ausgewählten Triterpenoid-Grundgerüste α-Amyrin, β-Amyrin, Lupeol und Cycloartenol durch mutierte Varianten der bakteriellen CYP102A1 (P450-BM3) aus Bacillus megaterium behandelt. Dazu wurden nach Durchmusterung der institutseigenen P450-BM3-Mutantenbibliothek die identifizierten relevanten Aminosäurereste sowie weitere Aminosäurepositionen systematisch mutiert. Die Mutante, die den höchsten Lupeol-Umsatz aufwies, wurde für Reaktionsoptimierungsversuche verwendet. Dabei konnte der Umsatz, vor allem durch Verwendung des Lösungsvermittlers (2-Hydroxypropyl)-β-cyclodextrin, auf ~98% gesteigert werden. Der Reaktionsmaßstab konnte darauffolgend vergrößert werden, sodass das Hauptprodukt isoliert und die Oxidationsposition durch NMR-Analysen aufgeklärt werden konnte. Dabei stellte sich heraus, dass durch die P450-BM3 V78G F87A I263G Dreifachmutante eine dreischrittige Oxidation von Lupeol zu dem (nach bestem Wissen) noch nicht bekannten Lupeol-Derivat 3β-Hydroxylup-20(29)-en-24-säure erfolgte. P450-BM3 V78G F87A I263G konnte auch zur Oxidation der weiteren Substrate α-Amyrin, β-Amyrin und Cycloartenol eingesetzt werden.Triterpenoids constitute a diverse group of natural products and show a multitude of interesting biological activities. The biotechnological production of triterpenoids is of interest, because these compounds are often isolated from plants in low amounts. In nature, cytochrome P450 monooxygenases (P450s or CYPs) catalyze the first oxidative functionalization steps of triterpenoid scaffolds in a selective manner. In this study, triterpenoid-specific plant P450 monooxygenases were characterized. Furthermore, the potential of engineered bacterial P450 monooxygenases for the oxidation of plant triterpenoids was evaluated. In the first part of this study, CYP71A16 and CYP705A12 from Arabidopsis thaliana that have not been previously biochemically characterized, were produced recombinantly in Escherichia coli and were subsequently characterized. Both cyp genes are located in an operon-like gene cluster together with the gene encoding the marneral synthase on Arabidopsis thaliana genome. CYP71A16 was known to hydroxylate the triterpenoids marneral and marnerol at position 23 in planta and in recombinant Saccharomyces cerevisiae. In this study, N-terminal altered versions of both P450 enzymes could be produced with high titers of 52 mg/L and 33 mg/L (CYP71A16 and CYP705A12) and were subsequently purified. A bacterial redox partner system consisting of YkuN from Bacillus subtilis and Fpr from E. coli were proved as more appropriate in in vitro experiments with CYP71A16 than the cytochrome P450 reductase ATR2 from A. thaliana. For the CYP71A16 catalyzed oxidation of marnerol to 23-hydroxymarnerol a KM value of 142 µM and a Kcat value of 3.9 min-1 could be determined. Furthermore substrate binding studies were recorded and a dissociation constant for CYP71A16 of 225 µM was established. Using GC/MS analysis an up to now not detected overoxidation product of 23-hydroxymarnerol was detected. No catalytic activity of CYP705A12 could be determined within the framework of this study. However, substrate binding studies revealed that the diterpenoid agatholal, that shows structural similarities to marnerol, was binding to CYP705A12. In the second part of this study, oxidation of the selected triterpenoid scaffolds α-amyrin, β-amyrin, and cycloartenol catalyzed by CYP102A1 (P450-BM3) variants from Bacillus megaterium was examined. For this purpose, the relevant amino acids that were identified in a screening of the P450-BM3 mutant library available at the institute, as well as further positions were systematically mutated. The P450-BM3 variant that led to the highest lupeol conversion was used for reaction optimization. Lupeol conversion could be increased to ~98%, expecially due to better substrate solubilization using (2-hydroxypropyl)-β-cyclodextrin. The reaction volume was increased and the position of oxidation of the main product was solved by NMR. It was proved that the P450-BM3 triple mutant V78G F87A I263G catalyzed the three-step oxidation of lupeol to the (to the best of one's knowledge) not yet known lupeol derivative 3β-hydroxylup-20(29)-en-24-oic acid. P450-BM3 V78G F87A I263G could be also applied for the oxidation of the further substrates α-amyrin, β-amyrin and cycloartenol. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 08.10.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 08.10.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 16.01.2019 | |||||||
| Datum der Promotion: | 25.03.2019 |
