Dokument: Analyse des unkonventionellen Sekretionsmechanismus der Chitinase Cts1 aus Ustilago maydis

Titel:	Analyse des unkonventionellen Sekretionsmechanismus der Chitinase Cts1 aus Ustilago maydis
Weiterer Titel:	Analysis of unconventional chitinase Cts1 secretion in Ustilago maydis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=50960
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190923-082937-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Aschenbroich, Jörn [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,86 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.09.2019 / geändert 20.09.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter] Dr. Linka, Nicole [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der konventionelle Sekretionsweg von eukaryotischen Proteinen beginnt mit dem Signalpeptid-abhängigen Eintritt ins Endoplasmatische Retikulum, in dem Prozesse zur Faltung und N-Glykosylierung erfolgen. Die intrazelluläre Route des sekretorischen Proteins setzt sich im Transport zum Golgi-Apparat für weitere Prozessierungsschritte fort und endet mit der durch sekretorische Vesikel vermittelten Freisetzung an der Plasmamembran. Neben der konventionellen Proteinsekretion existiert eine Vielfalt an Exportmechanismen, die vom klassischen Weg durch das Endoplasmatische Retikulum und den Golgi-Apparat abweichen und unter dem Terminus unkonventionelle Sekretion zusammengefasst werden. Im Maisbeulenbrandpilz Ustilago maydis wird die Chitinase Cts1 unkonventionell sekretiert. Bisherige Untersuchungen belegten für die Chitinase eine Signalpeptid-unabhängige Sekretion mit einer spezifischen Akkumulation des Proteins im Teilungsbereich zwischen Mutter- und Tochterzelle. Das spezifische Lokalisationsmuster von Cts1 in der späten Zellteilungsphase weist dabei auf eine Freisetzung hin, die in dem Abschnitt des Zellzyklus stattfindet, bei dem Mutter- und Tochterzelle getrennt werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die unkonventionelle Sekretion der Chitinase Cts1 im Zusammenhang mit der Zellteilung während des Zellzyklus steht. Mittels des Vergleichs der extrazellulären Aktivität der Chitinase und eines konventionell sekretierten Proteins, bei Arretierung des Zellzyklus, wurde eine Zellzyklus-abhängige Freisetzung von aktivem Cts1 nachgewiesen. Auf Grund des funktionalen Cts1-Exports in einigen Zellteilungsmutanten stellt die physische Trennung von Mutter- und Tochterzelle jedoch keine Voraussetzung für den Sekretionsprozess dar. Die Anwendungen der reversen Genetik und enzymatischer Aktivitätstests bewiesen den Einfluss zweier zuvor beschriebener Proteine auf die Sekretion der Chitinase. Bei Abwesenheit dieser an der sekundären Septenbildung beteiligten Proteine Don1 und Don3 sind die extrazellulären Aktivitäten von Cts1 und eines durch den Co-Export mit Cts1 freigesetzten Reporterproteins signifikant reduziert. Durch Quantifizierung der sekundären Septen in Zellteilungsmutanten wurde nachgewiesen, dass die Bildung des sekundären Septums jedoch nicht für die effektive Sekretion von aktivem Cts1 benötigt wird. Eine essentielle Rolle von Don3 in der Sekretion von Cts1 wurde mittels induzierter Expression von don3 im Deletionshintergrund bestätigt. Für Don1 und Don3 wurden somit Hinweise für eine jeweils weitere Funktion abseits der Beteiligung an der sekundären Septenbildung ermittelt, die für die Sekretion der Chitinase erforderlich erscheint. Zudem konnte gezeigt werden, dass Don3 in geringen Mengen exportiert wird. Durch die Analysen in der vorliegenden Arbeit wurden somit weiterführende Erkenntnisse generiert, die zur Aufdeckung des unkonventionellen Sekretionsmechanismus von Cts1 in U. maydis beitragen. The conventional secretory pathway of eukaryotic proteins is initiated by the signal peptide-dependent entry into the endoplasmic reticulum, in which processes for folding and N-glycosylation take place. The intracellular route of the secretory protein continues with the transport to the Golgi apparatus for further processing steps and ends with the release at the plasma membrane, mediated by secretory vesicles. In addition to the conventional secretion of proteins, a variety of export mechanisms exists that deviate from the classical pathway ER and Golgi apparatus and are summarized with the term unconventional secretion. The chitinase Cts1 is secreted unconventionally in the corn smut fungus Ustilago maydis. Previous studies have shown that the chitinase undergoes a signal peptide-independent secretion with a specific accumulation of the protein in the division zone between the mother and daughter cell. The specific localization pattern of Cts1 in the late cell division phase hints towards a release that takes place in the section of the cell cycle in which mother and daughter cells are separated. In this work studies on the potential connection of unconventional chitinase Cts1 secretion to cell division during the cell cycle were conducted. By comparing the extracellular activities of the chitinase and a conventionally secreted protein during cell cycle arrest, cell cycle dependent release of active Cts1 was detected. However, due to the functional Cts1 export in some cell division mutants, physical separation of mother and daughter cells is not a prerequisite for the secretion process. Applications of reverse genetics and enzymatic activity assays confirmed the effect of two previously described proteins on the secretion of the chitinase. In the absence of Don1 and Don3, two proteins required for secondary septum formation, the extracellular activities of Cts1 and a reporter protein released by co-export with Cts1 are significantly reduced. By quantifying secondary septa in cell division mutants, it was demonstrated that the formation of secondary septa is not required for the effective secretion of active Cts1. An essential role of Don3 in the Cts1 secretion was confirmed by induced expression of don3 in the deletion background. Thus, evidence for additional functions of both Don1 and Don3 apart from their involvement in secondary septa formation were obtained, which appear to be necessary for the secretion of the chitinase. In addition, it could be shown that Don3 is exported in small amounts. The results of the present study have generated further insights that contribute to deciphering the unconventional secretion mechanism of Cts1 in U. maydis.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	23.09.2019
Dateien geändert am:	23.09.2019
Promotionsantrag am:	10.05.2019
Datum der Promotion:	17.06.2019