Dokument: Der Einfluss von Metformin-Stimulation auf den Titin-Isoformen-Switch in embryonalen Rattenkardiomyozyten in Abhängigkeit von Autophagie-Aktivität und Expression des Spleißfaktors RBM20
| Titel: | Der Einfluss von Metformin-Stimulation auf den Titin-Isoformen-Switch in embryonalen Rattenkardiomyozyten in Abhängigkeit von Autophagie-Aktivität und Expression des Spleißfaktors RBM20 | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=50931 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20190919-111448-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Bärthlein, Katharina Anna [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Krüger, Martina [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Grandoch, Maria [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Metformin ist seit Jahrzehnten das weltweit am weitesten verbreitete orale Antidiabetikum. Für das Pharmakon konnte eine verbesserte Relaxationsfähigkeit des linken Ventrikels, also eine erhöhte Elastizität während der Diastole, gezeigt werden. Das muskuläre Strukturprotein Titin definiert die diastolische passive Spannung maßgeblich, weshalb die Vermutung nahe liegt, dass mechanische Titin-Eigenschaften durch Metformin direkt beeinflusst werden. In Kardiomyozyten wird Titin in der langen und elastischen N2BA- und in der kürzeren und damit steiferen N2B-Isoform koexprimiert. Die Titin-basierte Rigidität von Kardiomyozyten kann unter anderem über Änderungen dieses Titin-Isoformen-Verhältnisses beeinflusst werden. Perinatal findet ein sogenannter Isoformen-Switch statt, bei dem eine fötale N2BA-Isoform sukzessive durch die adulten N2BA- und N2B-Isoformen ersetzt wird. Diese Isoformen-Transition ist maßgeblich durch den Spleißfaktor RBM20 reguliert. Ziel dieser Arbeit ist es, den Einfluss von Metformin auf den Titin-Isoformen-Switch zu untersuchen. Dazu wurden embryonale Rattenkardiomyozyten in An- und Abwesenheit von Metformin im Zellkulturmodell kultiviert und das Isoformen-Verhältnis durch SDS-Gelelektrophorese zu unterschiedlichen Zeitpunkten bestimmt. So zeigten Metformin-behandelte Zellen zu frühen Kultivierungszeitpunkten signifikant höhere Level der N2B-Isoform, zu späteren Zeitpunkten hingegen einen signifikant niedrigeren N2B-Anteil. Dies gilt auch bei späterem Stimulationsbeginn ab Tag 7 in Kultur. Zusätzlich wurde die Proteinexpression des Spleißfaktors RBM20 mittels Western Blot untersucht. So korrelierte der Switch hin zu signifikant höheren N2B-Leveln unter Metformin zu frühen Kultivierungszeitpunkten mit signifikant erhöhten Proteinleveln von RBM20, also vermutlich einer hohen Spleiß-Aktivität. Zu späten Kultivierungszeitpunkten wurden, den signifikant geringeren N2B-Leveln unter Metformin entsprechend, signifikant niedrigere RBM20-Level festgestellt. Da Metformin im Allgemeinen als Aktivator der Autophagie bekannt ist, wurde Autophagie als Mediator des invertierten Metformin-Effekts angenommen. Anhand von Autophagie-Markern wurde eine hohe Metformin-vermittelte Autophagie-Aktivität mit erhöhtem N2B-Anteil auf Titin-Isoform-Ebene in Verbindung gebracht, geringerer N2B-Anteil mit niedriger Autophagie-Aktivität.
Die Metformin-Wirkung auf die kardiale Titin-Isoform-Komposition und Autophagie-Aktivierung differierte je nach Kultivierungsdauer und ist damit vermutlich vom Entwicklungsstadium der Zellen abhängig. Möglicherweise findet in diesem Versuchsaufbau ein metabolischer Switch von embryonaler Glykolyse hin zur Energiegewinnung durch β-Oxidation statt, was eine reduzierte Proliferationsfähigkeit der Kardiomyozyten mit sich bringt. Dieser Wechsel bedingt womöglich den veränderten Effekt von Metformin auf die Autophagie-Aktivierung und auf die Zusammensetzung der Titin-Isoformen. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass sich die Metformin-Wirkung vermutlich nicht nur je nach Gewebe unterscheidet, sondern auch in ein und derselben Zelle je nach Metabolismus und Proliferationsraten unterschiedliche Effekte nach sich ziehen kann.To date metformin is the worldwide most common orally applied antidiabetic pharmakon and has been associated with improved left ventricular elasticity and thus relaxation during diastole. As the scaffolding protein titin is a main predictor of diastolic passive tension in cardiomyocytes, it is hypothesized that metformin directly influences mechanical titin properties. In cardiomyocytes two titin isoforms are co-expressed: the long and therefore elastic N2BA-isoform as well as the shorter and stiffer N2B-isoform. A variation of this isoform ratio leads to modification of titin-based rigidity of cardiomyocytes. During perinatal heart development a fetal N2BA isoform is gradually replaced by adult N2BA- and N2B-isoforms. This process, which is referred to as titin-isoform-switch, is largely regulated by the splicing factor RBM20. The objective of this thesis is to examine the impact of metformin stimulation on the titin-isoform-switch. To this end, embryonic rat cardiomyocytes are cultivated in presence as well as in absence of metformin and the isoform ratio is analyzed via SDS-gel electrophoresis at different points in time of cell culture. While metformin stimulated cells exhibit a significantly increased level of the shorter and stiffer N2B-isoform during the first days in culture, N2B-levels drop significantly with the duration of cultivation. This observation still holds in cases where metformin stimulation only starts after 7 days in culture. Furthermore, the protein expression of the splicing factor RBM20 is examined using Western Blot analysis. In metformin treated cells RBM20 protein expression correlates with the titin-isoform-composition: the switch towards significantly higher N2B-levels in metformin stimulated cells during early cultivation is consistent with significantly higher RBM20-levels and thus presumably high splicing activity. The significantly lower N2B-levels in metformin treated cells after longer cultivation correlate with significantly reduced RBM20-levels. As metformin is generally known as an activator of autophagy, the autophagic process is assumed to be a mediator of the reversed metformin effect on titin properties. Autophagy markers show a connection between high autophagy activity and elevated N2B-levels, whereas lower N2B-levels can be associated with reduced autophagic activation. The metformin effect varies depending on cultivation duration and presumably on maturity level of embryonic rat cardiomyocytes. Possibly, a metabolic switch occurs in this experimental set-up. Embryonic ATP-production via glycolysis is replaced by fatty acid oxidation in mature cardiomyocytes, which leads to lower proliferation rates of the cells. This switch possibly causes the reversed effect of metformin on the autophagy activation and hence on the titin-isoform-composition. In summary, the metformin effect on titin properties is not only tissue dependent but may also vary depending on the metabolic and proliferative conditions. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Herz- und Kreislaufphysiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 19.09.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 19.09.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 12.02.2019 | |||||||
| Datum der Promotion: | 05.09.2019 |
