Dokument: Energetics and dynamics of lipase A activation by the steric chaperone Lif in Pseudomonas aeruginosa

Titel:	Energetics and dynamics of lipase A activation by the steric chaperone Lif in Pseudomonas aeruginosa
Weiterer Titel:	Energetik und Dynamik der Lipase A Aktivierung durch das sterische Chaperon Lif in Pseudomonas aeruginosa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=50912
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190918-102101-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Verma, Neha [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 51,99 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.09.2019 / geändert 17.09.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Gohlke, Holger [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Betreuer/Doktorvater]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Bakterielle Lipasen stellen eine wichtige Gruppe von Enzymen im biotechnologischen und biomedizinischen Bereich dar. Aufgrund ihrer Fähigkeit Glycerinester zu hydrolysieren, sind sie in der Lebensmittel-, Waschmittel- und Pharmaindustrie sehr gefragt. In den letzten Jahrzehnten ist sowohl die biotechnologische Optimierung dieser Lipasen, als auch ihre biotechnologische Produktion auf die Bedürfnisse der Industrie angepasst worden und somit auch zu einem wichtigen Forschungsthema in der Wissenschaft geworden. Der erste Schritt der biotechnologischen Produktion der Lipasen ist die Überexpression, die sich allerdings als sehr schwierig herausstellt hat. So benötigen Lipasen aus Pseudomonas und Burkholderia die Unterstützung der Lipase-spezifischen Foldase Lif, damit sie ihre katalytisch aktive Konformation erreichen. Nur Lipasen in ihrer aktiven Konformation können industriell genutzt werden, sodass ein starker Bedarf besteht den Faltungsmechanismus dieser Lipasen auf molekularer Ebene zu untersuchen und zu verstehen. Lipasen werden nach ihren Aminosäuresequenzen und biologischen Eigenschaften in acht Familien eingeteilt. Familie I umfasst die Vertreter der “echten” Lipasen, zu denen auch die Lipase A aus Pseudomonas aeruginosa (PaLipA) zählt. Abgesehen von ihrer kommerziellen Relevanz ist PaLipA ein bekannter Virulenzfaktor mit Relevanz in verschiedenen Krankheiten, wie Mukoviszidose. Ziel dieser Dissertation war es, den Aktivierungsmechanismus von PaLipA durch die Lipase-spezifische Foldase PaLif mittels computerbasierten Methoden, zusammen mit einer strukturellen Charakterisierung durch Fluoreszenzmessungen und in vitro Experimenten, zu untersuchen. Zunächst wurde eine computerbasierte Untersuchung der Foldase PaLif in Abwesenheit der entsprechenden Lipase durchgeführt. Dies ermöglichte die Charakterisierung der Funktionsdynamik der einzelnen Domänen von PaLif auf atomarer Ebene. Zweitens wurden NMR-Strukturen für die stabile Domäne MD1 von PaLif gelöst und die strukturellen Determinanten der MD1 Domäne bei der Aktivierung von PaLipA untersucht. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein potentieller Aktivierungsmechanismus abgeleitet, in dem auch weitreichende Wechselwirkungen, die sich von PaLif bis zum aktiven Zentrum von PaLipA erstrecken, eine Rolle spielen. Drittens wurde die Öffnungsenergie des aktiven Zentrums von PaLipA in An- und Abwesenheit von PaLif durch Molekulardynamiksimulationen quantifiziert. Zudem analysierte ich die wichtigsten Wechselwirkungen zwischen PaLif und PaLipA hinsichtlich der mechanischen Stabilität. Die vorliegende Arbeit liefert somit molekulare Einblicke in die Aktivierungsmechanismen von PaLipA durch PaLif, was nützlich sein kann, um die biotechnologische Produktion von PaLipA im großen Maßstab zu optimieren. Bacterial lipases are an essential group of enzymes in the biotechnological and biomedical field. Due to their ability to hydrolyze esters of glycerol, they are highly demanded in food, dairy, detergent, and pharmaceutical industries. Over the last decades, optimization of these enzymes and their production to meet industrial needs has become a relevant research topic for the scientific community. For the production of these enzymes, the first step is overexpression, which turns out to be a difficult step. Lipases from Pseudomonas and Burkholderia need the assistance of the lipase-specific foldase Lif to achieve their active conformation before they are secreted and can be harvested. Therefore, there is a strong need to comprehend the folding mechanism of these lipases at the molecular level. Lipases are classified according to their amino acid sequences and biological properties into eight families. Family I represents “true” lipases. The lipase A from P. aeruginosa (PaLipA) is a prominent member of this family. Beyond its commercial relevance, it is a known virulence factor in many diseases such as cystic fibrosis. The goal of this thesis was to investigate the activation mechanism of PaLipA assisted by lipase-specific foldase PaLif by means of computational methods together with structural characterization by fluorescence measurements and in vitro experiments. First, a computational investigation of PaLif in the absence of its cognate lipase was performed. This allowed the characterization of functional dynamics of the individual domains of PaLif at an atomic level. Second, solution nuclear magnetic resonance structures have been solved for the structurally stable domain MD1 of PaLif. Based on this data, the structural determinants of this domain in the activation of PaLipA were investigated. These findings provide a putative mechanism of long-range interactions spanning from PaLif to the active site of PaLipA. Third, the energetics of active site opening in PaLipA with and without its foldase is quantified by unbiased and biased molecular dynamics simulations. Finally, I analyzed the key interactions between PaLif and PaLipA with respect to mechanical stability, which provides the basis for a possible mechanism of PaLipA activation via PaLif. The work done in this thesis provides a detailed understanding of the mechanistic insights of the activation process of PaLipA, which can be useful to optimize the production of this enzyme on a large scale.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	18.09.2019
Dateien geändert am:	18.09.2019
Promotionsantrag am:	30.07.2019
Datum der Promotion:	26.08.2019