Dokument: Molekulare Analyse von ABC-Transportern am Beispiel von Pdr5p aus S. cerevisiae und der isolierten NBD des humanen TAP

Titel:	Molekulare Analyse von ABC-Transportern am Beispiel von Pdr5p aus S. cerevisiae und der isolierten NBD des humanen TAP
Weiterer Titel:	Molecular Analysis of ABC-Transporters - Pdr5p of S. cerevisiae and the isolated NBD of human TAP
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=5088
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20070709-105616-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ernst, Robert [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,90 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.07.2007 / geändert 06.07.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Stichwörter:	ABC-Transporter Pdr5p TAP membrane protein PDR catalytic dyad
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	ATP binding cassette (ABC) Transporter sind ubiquitäre Membranproteine, die durch die Hydrolyse von ATP die Translokation unterschiedlichster Substrate über biologische Membranen energetisieren. Trotz ihrer bedeutenden Rolle in einer Vielzahl von physiologischen und pathophysiologischen Prozessen sind zentrale mechanistische Fragen wie die molekulare Kopplung von ATP-Hydrolyse und Translokation oder der exakte Mechanismus der ATP-Hydrolyse nicht zuletzt wegen den komplexen Interaktionen funktional wichtiger Sequenzmotive bisher kaum verstanden. Die vorliegende Dissertation ist dem Zusammenspiel katalytisch relevanter Aminosäuren bei der ATP-Hydrolyse sowie der Etablierung von Methoden gewidmet, die systematische Analysen der Kommunikation zwischen den Motor- und Transmembrandomänen eines ABC-Transporters ermöglichen. Im ersten Teil der vorliegenden Dissertation wurde durch eine biochemische und biophysikalische Charakterisierung einer isolierten Nukleotid bindenden Domäne (NBD) des humanen Transporters assoziiert mit der Antigenprozessierung (TAP) eine katalytische Dyade aus einem Glutamat und einem Histidin als Wirkprinzip der ATP-Hydrolyse identifiziert. Das Glutamat hat dabei eine strukturgebende Rolle auf die Seitenkette des konservierten Histidins, das den pentakovalenten Übergangszustands der ATP-Hydrolyse stabilisiert und dadurch essentiell für die ATP-Hydrolyse ist. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der ABC-Transporter Pdr5p aus S. cerevisiae überproduziert und gereinigt. Nach Optimierung konnten pro Liter Kulturvolumen 700 µg dieses eukaryotischen 175 kDa Membranproteins in reiner, stabiler und monodisperser Form gewonnen werden. In Detergenzlösung kann Pdr5p ATP weder hydrolysieren noch binden. Eine detaillierte Analyse des Detergenz-vermittelten Aktivitätsverlustes mit mehr als 30 Detergenzien zeigte, dass Pdr5p höchstwahrscheinlich in einer nativen, aber nicht funktionalen Konformation arretiert vorlag. Im dritten Teil wurden Struktur-Funktionsbeziehungen von Pdr5p parallel in vivo und in vitro untersucht. Für die Beobachtung einer steady-state ATPase-Aktivität war in Pdr5p im Gegensatz zur isolierten NBD von TAP1 das konservierte Glutamat der putativen katalytischen Dyade essentiell, während eine Mutation des Histidins diese Aktivität nicht beeinflusste. Diese Studien liefern einen deutlichen Hinweis dafür, dass ABC-Transporter ATP anhand unterschiedlicher Mechanismen hydrolysieren können. Bemerkenswerterweise führte die systematische Analyse der erzeugten Mutanten zur Identifizierung einer bisher nicht beschriebenen Rolle des konservierten Histidins in der Substratauswahl dieses Multidrogentransporters. Die Ergebnisse dieser Dissertation können in einem Modell mit drei zentralen Postulaten zusammengefasst werden: i) ABC-Transporter spalten ATP anhand unterschiedlicher Mechanismen. ii) ABC-Transporter nutzen diese unterschiedlichen Mechanismen der ATP-Hydrolyse, um in alternativen Modi zu operieren: Einem basalen, vom Substrat entkoppelten Modus und einem Substrat-stimulierten, an Substrattransport gekoppelten Modus. iii) Das konservierte Histidin des H-loop spielt eine zentrale Rolle als Substrat-Sensor und ATPase-Regulator. Diese Doppelrolle in der Koordination von ABC-Transportern wird durch die unmittelbare Nähe zum γ-Phosphat des gebundenen ATP und die direkte Interaktion mit dem Glutamat in einer möglichen katalytischen Dyade gewährleistet. ATP binding cassette-transporters (ABC-transporters) are found in all kingdoms of life. They use the energy of ATP-hydrolysis for the translocation of an enormous spectrum of diverse substrates across biological membranes. Despite their crucial role in a number of physiological and pathophysiological processes, some central mechanistic questions like the coupling of ATP-hydrolysis with substrate translocation or the exact mechanism of ATP-hydrolysis are still poorly understood. This thesis is dedicated to the elucidation of the complex interplay of catalytic relevant amino acids during ATP-hydrolysis and to the development of new approaches that allow a systematic analysis of the communication between the motor and transmembrane domains of ABC-transporters. Based on the biochemical and biophysical characterisation of an isolated nucleotide binding domain (NBD) of the human transporter associated with antigen processing (TAP), a catalytic dyad as the working principle for ATP-hydrolysis was identified in the first part of this thesis. Any mutation or biochemical disruption of this catalytic dyad resulted in specific effects on nucleotide affinity, stability of the TAP1-homodimer or steady-state ATPase-activity. A systematic analysis of the generated mutants proved that the residues of the catalytic dyad, the conserved histidine of the H-loop and the glutamate C-terminally of the Walker B motif, interact in a distance- and pH-dependent manner. The glutamate of the catalytically dyad modulates the catalytic activity by imposing a structural constraint on the side chain of the histidine, whereas the histidine is essential for ATP-hydrolysis by stabilising the pentacovalent transition state of the reaction. The second part of this thesis describes the construction of a new strategy for the overproduction and affinity purification of any yeast protein. Based on the overexpression of PDR5 in a pdr1-3 strain background, this new and versatile tool was especially designed for genome-wide, high-throughput studies of protein overexpression and purification. This newly designed tool was used in the third part of the thesis to overproduce and purify Pdr5p from S. cerevisiae. The purification yielded 700 µg per litre culture of this 175 kDa membrane protein in a pure, stable and monodisperse form. The purified protein could neither hydrolyse nor bind ATP. A detailed analysis of the detergent-mediated loss of activity with more than 30 detergents showed, that Pdr5p is most likely arrested in a native, but non-functional conformation. Structure-function relations in Pdr5p were determined in the fourth part of this thesis. After mutagenesis employing a PDR5 Knock-in cassette, the in vivo drug resistance phenotype was analysed in parallel to the in vitro Pdr5p-specific ATPase-activity and transport activity. It could be shown, that the NBDs of Pdr5p are functionally asymmetric. While an ATPase-active C-terminal NBD is essential for function, the N-terminal NBD plays a rather regulatory role. In order to decipher the mechanism of ATP-hydrolysis in more detail, the identified catalytic dyad was mutagenised and characterised also in Pdr5p. Surprisingly and in contrast to the isolated NBD of human TAP1, it could be shown that the conserved glutamate is essential for steady-state ATPase activity, while this activity is not affected by a mutation of the histidine of the H-loop to alanine. These studies provide clear evidence that ABC-transporter may hydrolyse ATP by different mechanisms. Interestingly, the parallel in vitro and in vivo analysis of the generated Pdr5p-mutants identified a second, previously not described function of the histidine of the H-loop in selecting substrates. Despite the fact, that the conserved histidine is in close proximity to the γ-phosphate moiety of ATP at the interface of the NBD sandwich dimer, its mutation mediated a drastic change in the substrate selection within the TMDs. These observations support a dual role of the conserved histidine as substrate sensor and as regulator of ATPase-activity. The results of this thesis can be summarized in a model with three central postulates: i) ABC-transporters hydrolyse ATP by different mechanisms. ii) ABC-transporters employ these different mechanisms to operate in different modes: a basal, substrate uncoupled and a substrate-stimulated, coupled mode. iii) The conserved histidine of the H-loop plays a crucial role as substrate sensor and ATPase-regulator. This dual role in the coordination of an ABC-transporter is warranted by direct interaction with the glutamate in a feasible catalytic dyad.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	06.07.2007
Dateien geändert am:	06.07.2007
Promotionsantrag am:	16.05.2007
Datum der Promotion:	05.07.2007