Dokument: Making Gold from Waste: Catalytically-active Inclusion Bodies as biologically-produced Immobilizates for Biocatalysis
| Titel: | Making Gold from Waste: Catalytically-active Inclusion Bodies as biologically-produced Immobilizates for Biocatalysis | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=50874 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20190918-112734-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Jäger, Vera D. [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Biokatalyse, Immobilisierung, Enzyme, Inclusion Bodies | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Das heutige Bewusstsein einer stetig wachsenden Bevölkerung über Klimawandel und steigende ökonomische Anforderungen begünstigt die Förderung umwelt-schonenderer Prozesse in der modernen Industrie. Die Biokatalyse als „grüne“ Alternative erlangt, nicht zuletzt wegen ihrer hohen Chemo-, Regio- und Stereoselektivität, besonders in der Produktion von Feinchemikalien, zunehmende Popularität. Andererseits erfordert die klassische Biotechnologie oft schwierige Reaktionsbedingungen, wie hohe Temperaturen, extreme pH-Werte oder die Verwendung organischer Lösemittel. Dies resultiert häufig in einer Inaktivierung der Biokatalysatoren, was jedoch durch Enzymimmobilisierung teilweise kompensiert werden kann. Enzymimmobilisierung, also die Bindung an oder der Einschluss des Enzyms in Trägermaterialien, bedarf aufwendiger und dadurch teurer Reinigungs-, und Immobilisierungsschritte. Aus diesem Grund werden einfache, universelle und nach Möglichkeit trägerfreie Methoden zur Enzymimmobilisierung benötigt, um dem industriellen Anspruch nach stabilen, einfach zu produzierenden, sauberen Enzympräparationen gerecht zu werden.
Die in dieser Arbeit intensiv charakterisierten katalytisch aktiven inclusion bodies (CatIBs), als biologisch produzierte, trägerfreie Immobilisate, erfüllen eben diese Ansprüche. CatIB-Bildung basiert auf der Fusion einer coiled-coil Domäne an ein Zielenzym/ protein, wodurch die Bildung intrazellulärer Proteinaggregate, sogenannter inclusion bodies (IBs) induziert wird, die jedoch einen gewissen Anteil an Aktivität besitzen. Die Herstellung von CatIBs ist ausgesprochen einfach und ökonomisch, da nach der Produktion in Escherichia coli und dem anschließenden Zellaufschluss nur ein Waschschritt notwendig ist. Als Ergebnis wird ein immobilisierter, zellfreier Biokatalysator erhalten, der direkt für die Biokatalyse eingesetzt werden kann. In dieser Arbeit wurde eine „Toolbox“, von Fusionsproteinen, bestehend aus zehn unterschiedlichen Zielenzymen und -proteinen, sowie zwei coiled-coil Domänen als Aggregationsvermittler, etabliert, mit denen eine große Bandbreite verschiedener Enzymklassen mit variierenden Komplexitäten abgedeckt werden konnte. Zielenzyme, mit deren Hilfe bestimmte Fragen der CatIB Methode untersucht wurden, waren z.B. die Benzaldehydlyase aus Pseudomonas fluorescens (PfBAL), die Alkoholdehydrogenase aus Ralstonia sp. (RADH) und die konstitutiv exprimierte Lysin-decarboxylase aus Escherichia coli (EcLDC). Für alle Zielenzyme/-proteine konnten nach Optimierung katalytisch aktive oder funktionale inclusion bodies (CatIBs oder FIBs) gewonnen werden. Genfusionen wurden so konzipiert, dass das Optimierungspotential der CatIB Bildung ausgeschöpft und biotechnologisch relevante Eigenschaften der CatIBs systematisch überprüft werden konnten. Als Optimierungswege wurden die An- bzw. Abwesenheit eines Polypeptidlinkers, die Position der coiled-coil Fusion (N- vs. C-terminal) sowie die Verwendung alternativer coiled-coil Domänen identifiziert. Insbesondere die Verwendung alternativer coiled-coil Domänen resultierte in der Bildung morphologisch unterschiedlicher CatIBs/FIBs, die entweder eine kompakte oder diffuse Natur aufwiesen. Diese Eigenschaft scheint zudem mit der Restaktivität der jeweiligen CatIB Präparation zu korrelieren, wobei diffuse CatIBs eine deutlich höhere Restaktivität aufwiesen, als die entsprechenden kompakten CatIBs. Durch Verwendung der CatIB/FIB Datensätze konnten Beziehungen zwischen Struktur und Funktion untersucht werden, mit denen die Vorhersagbarkeit der CatIB/FIB Methode adressiert wurde. Diese Analyse legen nahe, dass aufgrund von sequenz- und struktur-basierten, computergestützten Berechnungen die Aggregationstendenz eines jeweiligen Zielenzyms/-proteins prognostiziert werden kann. Untersuchungen zum Einfluss der Expressionsbedingungen auf die CatIB Produktion demonstrierten einerseits, wie robust das aktuelle Verfahren ist, zeigten jedoch gleichzeitig Optimierungsmöglichkeiten für eine höhere CatIB Ausbeute auf; wie pH Kontrolle oder Verringerung von Expressionstemperatur und -zeit. Des Weiteren wurde die Stabilität und Aktivität von PfBAL-CatIBs unter verschiedenen Reaktions-bedingungen untersucht. So wurde nachgewiesen, dass (i) unabhängig von der coiled-coil Domäne CatIBs in wässrigem Puffer stabiler sind als die entsprechenden löslichen Enzyme, und dass (ii) CatIBs, abhängig von der verwendeten coiled-coil Domäne, für den Einsatz in Ein- oder Zweiphasensystemen angepasst werden können. Der biotechnologische Einsatz von EcLDC-CatIBs zur Produktion von 1,5-Diaminopentan (DAP), einem wichtigen Baustein zur Produktion von Biopolyamiden, resultierte in Raum-Zeit-Ausbeuten konkurrenzfähig zu den besten literatur-beschriebenen Prozessen. Schließlich wurde die CatIB Methode um die Möglichkeit der Co-Immobilisierung mehrerer Proteine und Enzyme in Co-FIBs und Co-CatIBs erweitert. Dazu wurde mit Co-FIBs der Fluoreszenzreporterproteine YFP und mCherry die Co-Lokalisierung zweier Proteine in IB Partikeln demonstriert. Schließlich wurde mit (Co-)CatIBs von PfBAL und RADH eine simultane Zweienzym-Eintopf-Synthese zur Produktion von (1R,2R)-1-phenylpropan-1,2-diol, einer wichtigen Vorstufe für Arzneimittel, entwickelt. Dabei konnte die Konkurrenzfähigkeit von CatIB-basierten (Co-)Aggregaten erneut demonstriert werden. Die erhöhte Stabilität von (Co-)CatIBs im Vergleich zu löslichen gereinigten Enzymen, deutet darauf hin, dass unter Bedingungen, bei denen Enzymstabilität ein limitierender Faktor ist, die Verwendung von CatIBs und Co-CatIBs vorteilhaft für die Realisierung von Reaktionskaskaden sein kann. Zusammenfassend konnten aufgrund der in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse Fortschritte im Verständnis des CatIB/IB Bildungsprozesses erlangt, und gleichzeitig die allgemeine Eignung der CatIB-Immobilisierungsmethode nachgewiesen werden. Somit stellen CatIBs eine vielversprechende, neue Methode zur Herstellung von Enzymimmobilisaten, für die Anwendung in der synthetischen Chemie und Biokatalyse, dar.The awareness of today’s humanity about overpopulation and climate change along with rising economic standards have prompted the promotion of more environmentally benign processes in modern industry. Biocatalysis, as a ‘green’ alternative, has gained rising popularity during the last decades, not least due to the high chemo-, regio-, and stereoselectivity of biocatalysts, especially for the production of fine chemicals. On the other hand, the classical biotechnology often needs harsh reaction conditions such as high temperature, extreme pH values, or the use of organic solvents. In many cases this results in the rapid inactivation of the biocatalyst, which however can be partly compensated for by enzyme immobilization. Enzyme immobilization, e.g. classically defined as binding to, or encapsulation of enzymes in carrier materials, requires tedious and thereby expensive purification and immobilization steps. Therefore, simple, generic, and if possible, carrier-free methods for enzyme immobilization are needed to fulfil the industry’s need for stable, cheap, yet pure enzyme preparations. The here extensively characterized catalytically-active inclusion bodies (CatIBs), as biologically produced, carrier-free immobilizates, fulfil those requirements. CatIB-formation is achieved by genetic fusion of a coiled-coil domain to a target enzyme/ protein, which induces the formation of intracellular proteinaceous aggregates, so-called inclusion bodies (IBs), which retain a certain degree of activity. The production of CatIBs is remarkably easy and economical, since after production in the well-established production host Escherichia coli and subsequent cell lysis, only one washing step is needed. The result is an immobilized, cell-free biocatalyst, which can directly be applied for biocatalysis. In this thesis a ‘toolbox’ of fusion proteins consisting of ten different target enzymes and proteins, as well as two coiled-coil domains, as aggregation-inducing tag, was established. Target enzymes were chosen to cover a broad range of different enzyme classes of variable complexity. Target enzymes, that were repeatedly used throughout this thesis to address certain issues of the CatIB strategy, were e.g. the benzaldehyde lyase of Pseudomonas fluorescens (PfBAL), the Ralstonia sp. alcohol dehydrogenase (RADH), and the constitutive lysine decarboxylase of Escherichia coli (EcLDC). For all ten targets, catalytically-active or functional inclusion bodies (CatIBs or FIBs) could be obtained after optimization. Gene fusions were designed to investigate the potential for optimization of the CatIB-formation process and to systematically address the biotechnological relevant properties of CatIBs. As optimization approaches, the presence/absence of linker polypeptides, the site of coiled-coil fusion (N- vs. C-terminal), and the use of alternative coiled-coil domains were identified. In particular, the use of different coiled-coil domains resulted in the formation of morphologically distinct CatIBs/FIBs, being either of compact or diffuse nature. The latter property seems to be correlated with residual activity of the respective CatIB preparation, with diffuse CatIBs showing much higher residual activity than their corresponding compact counterparts. Utilizing the toolbox dataset, structure-function relations were studied to address the predictability of the CatIB/FIB strategy, revealing that sequence and structure-based computational methods can be used to predict the aggregation propensity of a given target. The influence of the expression conditions on CatIB production was studied, demonstrating the robustness of the current production method, while suggesting ways for CatIB-yield optimization, i.e. by pH control, reduction of expression temperature and cultivation time. The stability and activity of PfBAL-CatIBs under different reaction conditions was explored, which revealed that, (i) regardless of the employed coiled-coiled domain, CatIBs are stabilized compared to the soluble purified enzyme in aqueous buffer and (ii) depending on the employed coiled-coil domain, CatIBs can be tailored for the use in biphasic or monophasic reaction systems. The biotechnological application of EcLDC-CatIBs for the production of 1,5-diaminopentane (DAP), an important precursor for the production of bio-based polyamides, was demonstrated, resulting in space-time yields for DAP production that were competitive to the best described processes from literature. Last but not least, the CatIB strategy was extended to the co-immobilization of multiple proteins and enzymes to create Co-FIBs and Co-CatIBs. Co-FIBs of the fluorescent reporter proteins YFP and mCherry were utilized to demonstrate co-localization of two proteins within IB particles. Finally, a two-enzyme, one-pot cascade for the production of (1R,2R)-1-phenylpropane-1,2-diol, an important precursor for the calcium channel blocker diltiazem, was realized with (Co )CatIBs of PfBAL and RADH, again demonstrating the competitiveness of CatIB (co-)immobilizates. The improved stability of the (Co-)CatIBs, compared to the soluble purified enzymes, suggests that the use of CatIBs and Co-CatIBs can be beneficial for the realization of cascade reactions, i.e. under conditions where enzyme stability is a limiting issue. In conclusion, the results presented in this thesis advance our understanding of the CatIB/IB formation process and reveal the generic applicability of the CatIB-immobilization strategy, rendering CatIBs a promising, new enzyme preparation for application in synthetic chemistry and biocatalysis. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 18.09.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 18.09.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 01.02.2019 | |||||||
| Datum der Promotion: | 03.06.2019 |
