Dokument: Differentielle Handhabung von DNS-Topoisomerase IIalpha und IIbeta durch Säugerzellen

Titel:	Differentielle Handhabung von DNS-Topoisomerase IIalpha und IIbeta durch Säugerzellen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=5087
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20070706-124702-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Linka, Rene [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,77 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.07.2007 / geändert 06.07.2007
Beitragende:	Prof. Dr. med. Boege, Fritz [Gutachter] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Stichwörter:	Topoisomerasen
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Alle zellulären Funktionen, die die Manipulation der DNA erforderlich machen, sind von der Aktivität der DNA-Topoisomerasen abhängig. Wird die Spaltung doppelsträngiger DNA benötigt, so wie bei der Dekatenierung der Schwester-chromatiden in der Mitose, dann sind dafür Typ II-Topoisomerasen verantwortlich. Ausschließlich Wirbeltiere besitzen zwei genetisch unterschiedliche Isoformen einer Typ II-Topoisomerase, die Topoisomerasen IIa und IIb. Sie ähneln sich zwar in ihrer Struktur und ihrer biochemischen Aktivität, besitzen aber unterschiedliche biologische Funktionen. Die a-Isoform beispielsweise besitzt essentielle Funktionen bei der Zellteilung, die durch die b-Isoform unter physiologischen Bedingungen nicht gewährleistet werden können. Das b-Enzym hingegen besitzt wichtige Funktionen bei der Regulation neuronalentwicklungsrelevanter Gene und ist die einzige Typ II-Topoisomerase in ruhenden Zellen. Bisher ist weder klar, warum von der humanen Topoisomerase II zwei sehr ähnliche Isoformen existieren, noch durch welchen Mechanismus ihre spezi-fischen Funktionen auf molekularer Ebene bestimmt werden. Das Ziel der vorlie-genden Arbeit war es, diesen Mechanismus aufzuklären und die maßgeblichen Regulationsdomänen der Isoformen zu identifizieren, über die die Zelle die spezifischen Aufgaben der Isoenzyme kontrolliert. Um die strukturellen Merkmale zu identifizieren, die für ihre Unterschiede verantwortlich sind, wurden biofluoreszente Chimären der Isoformen hergestellt, in denen sowohl ihre stark divergenten N- als auch C-terminalen Bereiche unter-einander ausgetauscht waren. Die C-Termini beider Enzyme werden für ihre grundlegende katalytische Aktivität nicht benötigt. Diese Chimären wurden in humanen Zell-Linien hinsichtlich ihrer isoformspezifischen Lokalisation und ihrer Fähigkeit, einen letalen Topo IIa-knock out zu komplementieren, untersucht. Es stellte sich heraus, dass die C-terminale Region des a-Enzyms (i) seine charakteristische Assoziation an Metaphasechromosomen vermittelte und (ii) alle Enzyme, die mit ihm ausgestattet waren, befähigte, die Proliferation der Zellen zu unterstützen. Die C-terminale Region des b-Enzyms war unter physiologischen Bedingungen zu beidem nicht in der Lage. Nur wenn mit dieser Region ausgestattete Enzyme artifiziell überexprimiert wurden, zeigten sie eine geringe Komplementationskompetenz. Die untersuchten Fusionsproteine agierten aus-schließlich als funktionelle Homo- und nicht als Heterodimere. Untersuchungen der N-terminalen Bereiche deckten keinerlei isoformspezifische Funktionen dieser Regionen auf. Der Lokalisationsunterschied der Isoenzyme wurde mit geringerer Intensität bereits von ihren trunkierten C-Termini alleine widergespiegelt. Da diese keine Fähigkeit zur direkten DNA-Bindung besitzen, ist für ihre Assoziation an mitotische Chromosomen vermutlich eine spezifische Interaktion mit anderen chromo-somalen Proteinen verantwortlich. Isoformspezifische Funktionen scheinen in proliferierenden Zellen also durch Protein-Protein-Wechselwirkungen determiniert zu werden. Die Untersuchung entsprechender, trunkierter Enzymkerne erwies sich als nicht möglich, da ihre katalytische Aktivität durch die Fusion mit dem Gelb Fluoreszierenden Protein unterbunden wurde. Trotzdem schien ihre artifizielle Lokalisation an Metaphasechromosomen zytotoxisch zu sein. Zur Identifikation regulatorisch relevanter Interaktionspartner wurde das klassische Tandem-Affinitätsaufreinigungssystem gewählt, dessen Bestandteil auch ein Affinitäts-tag gegen Calmodulin ist. Dieser stellte sich als völlig ungeeignet für repräsentative Aufreinigungsergebnisse heraus. Entsprechende Konstrukte ließen sich nicht nur schwer in humanen Zellen exprimieren, sondern Proteinaufreinigungen über diesen tag waren darüber hinaus unzuverlässig, was die Ausbeute und vor allem ihre Reproduzierbarkeit anbelangt. Trotzdem zeigten diese ersten Ergebnisse, dass die humanen Topoisomerase II-Enzyme mit vielen verschiedenen Proteinen zu interagieren scheinen, von denen einige ausschließ-lich mit a oder b wechselwirken. Einerseits kann man viele Interaktionspartner erwarten, da die Isoformen in vielfältigen zellulären Aufgabenbereichen involviert sind. Andererseits sind gerade Proteine, die nur mit einer der beiden Isoformen interagieren, beste Kandidaten, um die isoformspezifischen Funktionen in Verte-bratenzellen zu vermitteln. Zusammenfassend zeigen diese Daten, dass die divergente C-terminale Region der humanen Topoisomerase IIa dem konservierten Enzymkern (dem beider Enzyme) eine eindeutige und proliferationsassoziierte Funktionalität verleiht, während die b CTR in dieser Hinsicht weit weniger effizient ist. Die beiden CTR der Isoformen bestimmen ihre spezifische Lokalisation und scheinen so ihre individuellen Funktionen in proliferierenden Zellen zu vermitteln. All cellular DNA metabolic processes require the catalytic activity of DNA-topoisomerases. The cleavage of double-stranded DNA, which is necessary e. g. for the decatenation of the sister chromatides during mitosis, is provided by type II-topoisomerases. Vertebrate cells exclusively express two genetically distinct isoforms of a type II-topoisomerase, the topoisomerases IIa and IIb. They share similar structures and biochemical activities but have different biological roles. Topoisomerase IIa has essential functions during cell proliferation, whereas IIb is incapable of tackling them under physiological conditions. However, the b-enzyme is essential for the regulation of nerve growth and brain development and is the only type II-topoisomerase available in quiescent cells. It is still not resolved why human topoisomerase II is split into two similar isoforms and it is also unclear what kind of molecular mechanism determines isoform specific functions in the vertebrate cell. The aim of my doctoral thesis was to resolve this mechanism and to identify putative regulatory domains of each isoform, recognised and used by the cell to mediate isoenzyme specific tasks. To identify the structural features responsible for these differences, bio-fluorescent chimeras were designed via exchange of the divergent N-terminal and C-terminal regions (CTR) of the isoforms. The C-terminal domains are dispensable for the enzyme’s basic catalytic activity. The resulting hybrids were tested with respect to their isoform-specific localisation and their ability to complement a conditional topoisomerase IIa knock out in human cells. It turned out that (i) the CTR of the a-isoform mediated its characteristic binding to metaphase chromosomes, and that (ii) proliferation was fully supported by all enzymes equipped with the a CTR. Under physiological conditions the b-enzyme’s CTR was not able to do either of it. Enzymes bearing the b CTR merely supported proliferation when expressed at unusually high levels. The analysed fusion proteins were fully functional homodimers, but not heterodimers. Similar analyses of the divergent N-terminal regions revealed that these play no role in isoform-specific functions. Even for the truncated C-terminal regions alone the difference in isoenzyme localisation has been found. Since these regions do not possess DNA binding activity we predict other chromosomal proteins to specifically interact with the CTR, thereby allocating them to the mitotic chromosomes. Thus isoform specific protein-protein-interactions are likely to be the molecular mechanism governing isoform specific functions in proliferating cells. The investigation of corresponding enzyme cores was hindered by their lack of catalytic activity due to a fusion with the yellow fluorescent protein. Nevertheless their artificial targeting to mitotic chromosomes turned out to be cytotoxic. The classical tandem affinity purification method was chosen to identify relevant interaction partners. An affinity tag comprising a calmodulin binding peptide is part of that system, which emerged as completely unsuitable, regarding representative data. Corresponding constructs were hard to express in human cells. Moreover protein purifications via this tag were not well reproducible and had low yields. Nevertheless, preliminary results indicate that topoisomerase II interacts with multiple proteins, whereof some were unique for either a or b. On one hand, the multiple interaction partners are expected due to the enzyme’s multiple cellular functions, but on the other hand, unique proteins are our prime candidates for mediating isoform specific functions in vertebrate cells. In conclusion, these data show that the divergent CTR of the human topoisomerase IIa confers a unique proliferation-associated functionality to the topoisomerase II core enzyme (either version of it), whereas the b CTR is much less efficient in this respect. It is therefore plausible that the two versions of the CTR cooperate in differential targeting of topoisomerase IIa and IIb, thus providing unique functionality of the two isoforms in proliferating cells.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	06.07.2007
Dateien geändert am:	06.07.2007
Promotionsantrag am:	11.05.2007
Datum der Promotion:	21.06.2007