Dokument: Genexpressionsanalyse einzelner CTCs zur Charakterisierung der inter-zellulären Heterogenität hinsichtlich endokriner Resistenzmechanismen

Titel:	Genexpressionsanalyse einzelner CTCs zur Charakterisierung der inter-zellulären Heterogenität hinsichtlich endokriner Resistenzmechanismen
Weiterer Titel:	Gene expression analysis of single CTCs for characterization of inter-cellular heterogeneity in terms of endocrine resistance mechanisms
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=50561
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190822-101947-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. med. Reinhardt, Florian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,96 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.08.2019 / geändert 19.08.2019
Beitragende:	Prof. Dr. rer. nat. Neubauer, Hans [Gutachter] Prof. Dr. Czekelius, Constantin [Gutachter] Prof. Dr. med. Fehm, Tanja [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Mammakarzinom stellt eine heterogene Erkrankung dar, welche durch verschiedene histologische und molekulare Subtypen geprägt ist. Gegenwärtig basiert die Auswahl und Indikation einer Therapie auf den biologischen Eigenschaften des Primärtumors. Etwa 70 % aller Mammakarzinome exprimieren Hormonrezeptoren und gelten damit als endokrin sensitiv. Die Wirksamkeit endokriner Therapien ist jedoch durch primäre und sekundäre Resistenzen limitiert. Zahlreiche mögliche molekulare Resistenzmechanismen wurden beschrieben, wie eine veränderte Expression von ER, Mutationen des ESR1 Gens, eine veränderte Expression von Wachstumsfaktor-Rezeptoren, die Aktivierung des PI3K/Akt/mTOR Signalweges, eine veränderte Expression von Zellzyklusregulatoren, eine Dysregulation von ER Co-Aktivatoren, die Autophagie, die Epithelial-Mesenchymale Transition sowie eine verstärkte Tumorheterogenität. Innerhalb eines Primärtumors existieren verschiedene Subklone, die eine Therapieresistenz bedingen können sowie unterschiedliche Neigungen zur Metastasierung besitzen. Bereits früh im Krankheitsverlauf zeigen Mammakarzinom-Patientinnen eine hämatogene Streuung von Tumorzellen. Diese im Blut zirkulierenden Tumorzellen (CTCs) gelten als Vorläuferzellen von Metastasen. CTCs haben sich als wichtiger Surrogat-Marker für die Prognose von Mammakarzinom-Patientinnen erwiesen. Die Charakterisierung einzelner CTCs könnte damit wichtige Informationen hinsichtlich therapeutischer Zielstrukturen sowie möglicher Resistenzmechanismen liefern. Das Ziel dieser Arbeit bestand daher in der Charakterisierung der intra-individuellen Heterogenität einzelner CTCs hinsichtlich therapeutischer Zielstrukturen endokriner Therapien sowie möglicher endokriner Resistenzmechanismen bei metastasierten Mammakarzinom-Patientinnen mit Resistenzen gegenüber endokrinen Therapien. Die Etablierung und Validierung von Multi-Marker-Genexpressionsanalysen auf Einzelzellebene erfolgte an endokrin-responsiven MCF-7, endokrin-resistenten MCF-7/TAMR1 und nicht endokrin-responsiven MDA-MB-231 Zelllinien-Zellen. Die Genexpressionsprofile einzelner MCF-7, MCF-7/TAMR1 und MDA-MB-231 Zellen zeigten vorwiegend vergleichbare Genexpressionsprofile wie entsprechende Zell-Pools. Einzelne MCF-7, MCF-7/TAMR1 und MDA-MB-231 Zellen offenbarten Zelllinien-spezifische Charakteristika. Die Behandlung der Zellen mit CellSave®, einer Permeabilisierung oder der Kombination aus beidem hatte keine signifikanten Effekte auf die Genexpression im Vergleich zu nativen Zellen. Dagegen war die RNA nach Verwendung des CellSearch® CTC Kits bei Zelllinien-Zellen sowie CTCs nicht für weitere Experimente geeignet. Nach Anreicherung mittels Diagnostischer Leukapherese (DLA) und ParsortixTM-Systems war die RNA-Qualität in 30 % der analysierten CTCs ausreichend gut. Klinisch zeigte sich zum Zeitpunkt der DLA ein Progress der Patientin unter endokriner Therapie mit einem Aromataseinhibitor. Die Genexpressionsanalysen einzelner CTCs offenbarten eine hohe Plastizität sowie intra-individuelle Heterogenität hinsichtlich endokriner und phänotypischer Marker. Es zeigten sich sowohl ER-positive als auch ER-negative CTCs. Zudem zeigten sich HER2-positive CTCs bei HER2-negativem Primarius sowie der Nachweis von Wachstumsfaktorrezeptoren (EGFR, IGFR, FGFR) auf CTCs. Einzelne CTCs wiesen zudem EMT Marker (TWIST) sowie Marker eines mesenchymalen Phänotyps (VIM) auf. In allen CTCs konnte die Expression von CD44 nachgewiesen werden. Nach hierarchischen Clusteranalyse offenbarten sich CTC-Subgruppen, deren Expression sich signifikant in der Expression phänotypischer Marker (CD24, MYC) sowie Marker endokriner Signalwege (FOXO, PTEN) unterschied. Zudem zeigte sich in der ER-positiven CTC-Subgruppe im Vergleich zur ER-negativen CTC-Subgruppe eine signifikant höhere CyclinD1 Expression, die eine Zielstruktur endokrin basierter Therapien mit CDK4/CDK6 Inhibitoren darstellt. Darüber hinaus erfolgte die Genexpressionsanalyse einzelner kultivierter CTCs (cCTCs), welche aus der gleichen kryokonservierten DLA-Probe nach Anreicherung mittels ParsortixTM-Systems kultiviert wurden. Dabei zeigte sich in 50 % der analysierten cCTCs eine gute RNA-Qualität. Analog zu CTCs konnte auch eine hohe Plastizität sowie intra-individuelle Heterogenität hinsichtlich endokriner (ER, PR) und phänotypischer Marker bei cCTCs aufgezeigt werden. Es konnten auch ER-positive sowie ER-negative CTCs detektiert werden. Zudem offenbarten sich analog zu CTCs neben HER2-negativen cCTCs HER2-positive cCTCs. Alle cCTCs exprimierten MUC1. Subgruppenanalysen zeigten cCTC-Subpopulationen auf, die sich signifikant in der Expression phänotypischer Marker (EpCAM, CD 44, MUC1) unterschieden. Interessanterweise zeigten die Transkriptionsprofile von CTCs und cCTCs keine räumliche Abgrenzung, sondern eine teilweise gemeinsame Subgruppenbildung. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit ein robuster, schneller und kosteneffizienter Arbeitsablauf zur Gewinnung einzelner CTCs mittels DLA und ParsortixTM-Systems mit anschließender Charakterisierung auf Transkriptom-Ebene für mögliche endokrine Resistenzmechanismen sowie therapeutischer Zielstrukturen endokriner Therapien erfolgreich etabliert werden. Zum ersten Mal konnten Genexpressionsprofile einzelner nicht-kultivierter und kultivierter CTCs einer Patientin mit metastasiertem Mammakarzinom erstellt werden. Die Genexpressionsanalysen einzelner CTCs sowie kultivierter CTCs offenbarten mögliche endokrine Resistenzmechanismen sowie therapeutische Zielstrukturen endokriner Therapien. Schlussendlich sind diese Technologien vielversprechende Werkzeuge für zukünftige CTC-Analysen, die möglicherweise eine klinische Relevanz bei der Stratifizierung von Patienten zu entsprechenden Therapien sowie der Therapieoptimierung haben. Zuvor sind jedoch die Festlegung von klinischen Standards sowie die Durchführung translationaler Studien notwendig. Breast cancer is a heterogeneous disease with multiple distinct histologic and molecular subtypes. Indications for therapy and treatment recommendations are currently based on the biologic features of the primary tumor. Approximately 70 % of all breast cancers express hormone receptors and are therefore endocrine sensitive. However, the effectiveness of endocrine therapies is limited by primary and secondary endocrine resistance. Several molecular resistance mechanisms were proposed which include alterations in the ER expression, ESR1 mutations, altered expression of growth factor receptors, the activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway, dysregulation of ER co-activators, altered expression of cell cycle regulators, autophagy, epithelial to mesenchymal transition as well as increased tumor heterogeneity. Primary tumors consist of several subclones, which could lead to therapy resistance and harbor different tendencies to metastasize. Breast cancer patients show an early hematogenous dissemination of tumor cells in course of disease. Circulating tumor cells (CTCs) represent precursor cells of metastatic disease and they have become a surrogate marker for prognosis of breast cancer patients. Characterization of single CTCs could reveal important information concerning therapy target molecules as well as possible resistance mechanisms. Therefore, the aim of the study was the characterization of intra-individual heterogeneity of single CTCs in terms of the expression of molecules targeted by endocrine therapy as well as possible endocrine resistance mechanisms in metastasized breast cancer patients with endocrine therapy resistance. The establishment and validation of a multi-marker gene expression analysis on single cell level was performed with endocrine responsive MCF-7, endocrine resistant MCF-7/TAMR1 and endocrine unresponsive MDA-MB-231 cell line cells. Gene expression profiles of single MCF-7, MCF-7/TAMR1 and MDA-MB-231 cells revealed mostly comparable gene expression profiles to pools of cells. Single MCF-7, MCF-7/TAMR1 and MDA-MB-231 cells showed cell line specific characteristics. Treatment of cells with CellSave®, permeabilization or the combination of both revealed no significant differences compared to controls. However, no cell line cells and CTCs of sufficient RNA quality could be found after processing with the CellSearch® CTC kit and the CellSearch®-System. After enrichment via diagnostic leukapheresis (DLA) and ParsortixTM system, gene expression analysis revealed a good RNA quality in 30 % of analyzed CTCs. At the time of DLA, the patient revealed a progress under aromatase inhibitor therapy. Gene expression analysis of single CTCs revealed a high plasticity as well as intra-individual heterogeneity in terms of endocrine and phenotypic markers. ER-positive as well as ER-negative CTCs were present. Moreover, HER2-positive CTCs were detectable regarding the HER2 negative primary tumor and growth factor receptors (EGFR, IGFR, FGFR) were present on CTCs. Single CTCs also revealed EMT markers (TWIST) as well as markers for a mesenchymal phenotype (VIM). Transcripts of the stem cell marker CD44 could be detected in all CTCs. Hierarchical clustering showed CTC subgroups, whose expression differed significantly in regard to phenotypic markers (CD44, MYC) and markers of endocrine signaling pathways (FOXO, PTEN). Moreover, the ER-positive CTC subgroup showed a significant higher expression of CCND1 in comparison to the ER-negative subgroup. Additionally, gene expression analysis was performed of single cultured CTCs (cCTCs) which were cultured of the same cryopreserved DLA probe after enrichment via the ParsortixTM system. 50 % of analyzed cCTCs revealed a good RNA quality, respectively. Consistent with CTCs, cCTCs also demonstrated a high plasticity as well as intra-individual heterogeneity regarding endocrine (ER, PR) and phenotypic markers. Analysis revealed ER-positive as well as ER-negative cCTCs. In line to CTCs, cCTCs were HER2-positive as well as HER2-negative. All cCTCs expressed MUC1. Gene expression profiles showed cCTCs subgroups, which differed significantly in the expression of phenotypic markers (EpCAM, CD44, MUC1). Interestingly, gene expression profiles of CTCs and cCTCs showed no clear distinction rather a partly combined grouping. In summary, a robust, rapid and cost-efficient workflow was successfully established for enrichment of single CTCs by DLA and ParsortixTM-system with subsequent characterization on the transcriptomic single cell level for endocrine resistance mechanisms as well as relevant therapeutic targets for endocrine therapies. For the first time, single gene expression profiles of uncultured and cultured CTCs of the same metastatic breast cancer patient could be generated. Gene expression profiles revealed possible endocrine resistance mechanisms as well as relevant therapeutic targets for endocrine therapies. Finally, these technologies constitute promising tools for CTC analysis which might have great potential for clinical decision-making but firstly standardization of protocols and translational studies are necessary.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	22.08.2019
Dateien geändert am:	22.08.2019
Promotionsantrag am:	28.01.2019
Datum der Promotion:	08.07.2019