Dokument: Einfluss β-adrenerger Stimulation auf die kardiale Myofilamentsteifigkeit

Titel:	Einfluss β-adrenerger Stimulation auf die kardiale Myofilamentsteifigkeit
Weiterer Titel:	Influence of β-adreneric stimulation on cardiac myofilament stiffness
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=50417
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190819-114037-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Lassak, Philipp [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,30 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.08.2019 / geändert 03.08.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Krüger, Martina [Gutachter] Univ.-Prof.Dr. Schmitt, Joachim [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die autonome Funktion des Herzens wird durch das vegetative Nervensystem reguliert. Am Arbeitsmyokard wird eine Steigerung der Leistung über die Bindung von Katecholaminen an β-Adrenorezeptoren (β-AR) vermittelt. Die Aktivierung des klassischen β-adrenergen Signalwegs in Kardiomyozyten resultiert in einer Aktivitätssteigerung der Proteinkinase A (PKA). In den Kardiomyozyten des Arbeitsmyokards werden von der PKA unter anderem die L-Typ-Kalziumkanäle und das die SERCA (sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase) inhibierende Phospholamban phosphoryliert, was zu einer Zunahme des Kalziumein- bzw. ausstroms während der Herzaktion führt. Des Weiteren werden die Proteine Myosin- binding-Protein C (MyBP-C) und Troponin I im Myofilament PKA-abhängig phosphoryliert; dies bewirkt zusammen eine Steigerung der Inotropie und Lusitropie. Ein Ziel dieser Arbeit war aufzuklären, ob auch Titin im Rahmen β-adrenerger Stimulation PKA-abhängig phosphoryliert wird und über eine daraus resultierende Verminderung der passiven Myofilamentsteifigkeit zur positiven Lusitropie beitragen kann. Titin bildet zusammen mit dem dicken und dünnen Filament das Sarkomer, die kleinste funktionelle Einheit der Herz-und Skelettmuskulatur. Ein Titinmolekül überspannt ein halbes Sarkomer von der Z-Scheibe bis zur M-Bande. Durch seine elastischen Eigenschaften im I-Band bestimmt Titin die passive Myofilamentsteifigkeit. Neben der vor allem aus kollagenem Bindegewebe bestehenden extrazellulären Matrix ist Titin ein bestimmender Faktor der passiven Steifigkeit der Herzmuskulatur, die für die diastolische Funktion des Herzens von großer Bedeutung ist. Außerdem spielt das Titinfilament, das als einziges Filament über die gesamte Länge des Sarkomers ausgebildet ist, eine entscheidende Rolle im Rahmen der längenabhängigen Aktivierung. Die längenabhängige Aktivierung bildet die molekulare Grundlage des Frank-Starling-Gesetzes des Herzen, das den Zusammenhang der Steigerung des Auswurfvolumens bei Steigerung des enddiastolischen Volumens der Ventrikel beschreibt. Die passive Steifigkeit von Titin kann unter anderem durch Phosphorylierung elastischer I-Band-Regionen moduliert werden (Linke und Hamdani, 2014). Eine PKA- (Yamasaki et al., 2002, Krüger und Linke, 2006), PKG- (Krüger et al., 2009) und ERK-abhängige (Raskin et al., 2012, Perkin et al., 2015) Phosphorylierung der N2-B unique sequence (N2-Bus) im I-Band von Titin führt zu einer Verminderung der passiven Steifigkeit. Eine PKCα-abhängige Phosphorylierung der PEVK-Region, die hauptsächlich aus Prolin (P), Glutamat (E), Valin (V) und Lysin (K) besteht und auch im I-Band von Titin liegt, führt zu einer Steigerung der passiven Steifigkeit (Hidalgo et al., 2009). CaMKIIδ phosphoryliert sowohl die N2-Bus als auch die PEVK-Region und führt zu einer Verminderung der passiven Steifigkeit (Hamdani et al., 2013c, Hidalgo et al., 2013). Mittels Massenspektrometrie wurden Serin- und Threonin-Reste innerhalb der N2-Bus und der PEVK-Region identifiziert, die von den oben genannten Kinasen phosphoryliert werden. In der N2-Bus konnte unter anderem die konservierte PKA-abhängige Phosphorylierungsstelle S4010 identifiziert werden (Kötter et al., 2013). In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss β-adrenerger Stimulation auf die passive Myofilamentsteifigkeit zunächst an isolierten adulten Rattenkardiomyozyten untersucht. In diesem Modell wurden über den gesamten Sarkomerlängenbereich tendenziell erniedrigte passive Kräfte im Vergleich zur Kontrolle gemessen, die jedoch nur bei einer Sarkomerlänge von 2,2 μm eine statistisch signifikante Verminderung der passiven Myofilamentsteifigkeit zeigten. Die Titinphosphorylierung wurde mit phosphospezifischen Antikörpern im Western Blot analysiert und zeigte sich an der Phosphorylierungsstelle S4010 in der N2-Bus für mit Isoproterenol oder mit dem β-Blocker Propranolol behandelten Kardiomyozyten nicht signifikant verändert. In weiteren Untersuchungen an isolierten, retrograd perfundierten Mäuseherzen wurde für eine β-adrenerge Stimulation mit Isoproterenol eine signifikante Verminderung der passiven Myofilamentsteifigkeit in Einzelzellmessungen nachgewiesen. Diese Änderungen der passiven Myofilamentsteifigkeit liegen im physiologischen Bereich, der in der Literatur mit 1,7 bis 2,3 μm angegeben wird (Allen und Kentish, 1985). Es ist somit anzunehmen, dass die hier nachgewiesene Änderung der passiven Myofilamentsteifigkeit auch im intakten Organ zu dem positiv lusitropen Effekt der β-adrenergen Stimulation beiträgt. Der Einsatz von Propranolol führte hier zu keiner signifikanten Änderung der passiven Steifigkeit. Die Analyse der Titinphosphorylierung erfolgte mit phosphospezifischen Antikörpern im Western Blot an vier unterschiedlichen Phosphorylierungsstellen – S4010 und S4099 in der N2-Bus, S11878 und S12022 in der PEVK-Region. Die vermutete Steigerung der PKA-abhängigen Phosphorylierung an S4010 konnte für eine alleinige Stimulation mit Isoproterenol nicht nachgewiesen werden. Dafür konnte bei einer gleichzeitigen Behandlung mit Propranolol und Isoproterenol, bei Überwiegen der β-adrenergen Stimulation, eine statistisch signifikante Steigerung der Phosphorylierung an S4010 gezeigt werden. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die signifikante Reduktion der passiven Myofilamentsteifigkeit nach β-adrenerger Stimulation nicht eindeutig einer veränderten Phosphorylierung der untersuchten Phosphorylierungsstellen zugeordnet werden konnte. Zukünftige Analysen sind nötig, um die Änderungen der Titinphosphorylierung im Rahmen der β-adrenergen Stimulation weiter aufzuklären. Auch die mögliche Identifizierung bisher unbekannter Phosphorylierungsstellen im Titin könnte in diesem Zusammenhang von großer Bedeutung sein. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit eine Abnahme der relativen längenabhängigen Aktivierung nach β-adrenerger Stimulation an permeabilisierten Papilliarmuskelfasern aus retrograd perfundierten Mäuseherzen gezeigt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen vermuten, dass die Abnahme der längenabhängigen Aktivierung sehr wahrscheinlich durch die Änderung der titinbasierten Myofilamentsteifigkeit bei β-adrenerger Stimulation verursacht wird. Weil neben Titin auch Troponin I und MyBP-C an der Regulation der längenabhängigen Aktivierung beteiligt sind und beide Proteine im Rahmen der β-adrenergen Stimulation phosphoryliert werden, bedarf es weiterer Untersuchungen zur Bestätigung dieses Zusammenhanges. The vegetative nervous system regulates the autonomic heart function. At the level of the cardiac myocytes, an increase of cardiac power is transmitted by catecholamines binding β-adrenergic receptors (β-AR). Activation of the classical β- adrenergic signal pathway results in an increased activation of protein kinase A (PKA). PKA phosphorylates amongst others L-type Calcium channels and Phospholamban, a protein which inhibits SERCA, inducing an increased cardiac calcium influx during systole. Further Myosin-binding-Protein C (MyBP-C) and Troponin I, both located in the myofilament, are phosphorylated by PKA resulting in an increase of inotropy and lusitropy. The major aim of this study was to reveal if titin is phosphorylated by PKA through β-adrenergic stimulation and contributes to lusitropy by decreased passive tension of the myofilaments. Together with the thick and thin filament, titin builds the sarcomere, the smallest functional unit of cardiac and skeletal muscles. One titin molecule spans a half sarcomere from Z-disc to M-band. Titin’s compliant I-Band regions determine passive stiffness of the myofilament. Besides the extracellular matrix component collagen, titin is the most important factor of myocardial passive tension, which is highly relevant in diastolic function of the heart. Furthermore, because of its giant length titin forms the structural backbone of the sarcomere continuously and is a central element in regulation of length dependent activation of the myocardium. Length dependent activation is the molecular basis of the Frank-Staling law of the heart, which describes the relationship between an increased stroke volume due to an increased end diastolic volume. Titin-based passive tension is modulated through phosphorylation of its compliant I-band regions (Linke und Hamdani, 2014). PKA- (Yamasaki et al., 2002, Krüger und Linke, 2006), PKG- (Krüger et al., 2009) and ERK-dependent (Raskin et al., 2012, Perkin et al., 2015) phosphorylation of N2-B unique sequence (N2-Bus) in titin’s I-band leads to a decrease in cardiomyocyte passive tension. PKCα-dependent phosphorylation of PEVK-region, which contains mostly proline (P), glutamate (E), valine (V) and lysine (K) and is also localised in titin’s I-band, leads to an increase in cardiomyocyte passive tension (Hidalgo et al., 2009). CaMKII phosphorylates amino acids in both, N2-Bus and PEVK-region, and leads to a decrease of passive tension (Hamdani et al., 2013c, Hidalgo et al., 2013). By the use of mass spectroscopy serine and threonine residues in the N2-Bus and PEVK-region, which are phosphorylated by the kinases mentioned above, were identified. In N2-Bus the conserved PKA-dependent phosphoside S4010 was described among others (Kötter et al., 2013). In this study, the influence of β-adrenergic stimulation on cardiac passive tension was investigated on adult rat cardiac myocytes. In this model, a statistically significant decrease in passive tension was only shown for a sarcomere length of 2.2 μm, even though there was a decrease in passive tension over the whole range. Titin’s phosphorylation was analysed by Western blot with phosphospecific antibodies. No statistically significant difference in phosphorylation was obtained at the phosphosite S4010 in the N2-Bus of cardiac myocytes between β-adrenergic stimulation with Isoproterenol and with the β- blocker Propranolol. In further studies with isolated retrograde perfused mouse hearts, a significant decrease of passive tension was detected in single cell measurements after stimulation with Isoproterenol. These changes in passive tension of myofilament were detected at the physiological sarcomere length range of 1.7 - 2.3 μm (Allen und Kentish, 1985). Therefore, it can be suggested that the shown decrease in passive tension contributes to the positive lusitropy of β- adrenergic stimulation in the non-failing heart. A treatment with the β-blocker Propranolol caused no significant change in passive tension. Titin’s phosphorylation was analysed in Western blot studies with phosphospecific antibodies against four different phosphosites – S4010 and S4099 in N2-Bus, S11878 and S12022 in PEVK-region. An increase of PKA-dependent phosphorylation at S4010 after a stimulation with Isoproterenol could not be shown. However, after a treatment with Propranolol and Isoproterenol and a dominance of β-adrenergic stimulation, a significant increase of phosphorylation at S4010 was detected. Taken together, the statistically significant decrease in passive tension after β-adrenergic stimulation could not be correlated with a distinct change in titin’s phosphorylation at the four analysed phosphosites. Further studies are needed to elucidate the change in titin’s phosphorylation at different phosphosites and their interactions through β- adrenergic stimulation. In this context, the identification of yet unknown phosphosites could play an important role. In addition, this study shows a decrease in length dependent activation of permeabilized papillary muscle strips through β- adrenergic stimulation of retrograde perfused mouse hearts. The results obtained in this study indicate, that the decrease in length dependent activation is most likely caused by altered titin-based myofilament passive tension. Because troponin I and MyBP-C are also involved in regulation of length dependent activation and both proteins are phosphorylated in reaction to β-adrenergic stimulation, further studies are needed to confirm the proposed model.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	19.08.2019
Dateien geändert am:	19.08.2019
Promotionsantrag am:	09.11.2018
Datum der Promotion:	30.07.2019