Dokument: Mechanismen der Zytotoxizität durch Alpha-Strahlung in humanen normalen und malignen hämatopoetischen Zellen

Titel:	Mechanismen der Zytotoxizität durch Alpha-Strahlung in humanen normalen und malignen hämatopoetischen Zellen
Weiterer Titel:	Molecular and functional effects of the alpha-emitting radioimmunoconjugate 213Bi-rituximab in B-cell lymphomas and primary CD19+ cells
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=5038
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20070702-115335-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Raschke, Sascha [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,13 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.07.2007 / geändert 02.07.2007
Beitragende:	PD Dr. Kronenwett, Ralf [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Wagner, Rolf [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der gezielte Transport von Radioisotopen mit einem hohen linearen Energietransfer und einer niedrigen Reichweite, wie z.B. Alphastrahler, direkt an Tumorzellen unter Einsatz von monoklonalen Antikörpern ist eine viel versprechende Strategie zur Behandlung von Krebserkrankungen. Da wenig über die biologischen Effekte von Alphastrahlung bekannt ist, wurde in dieser Arbeit die molekulare Wirkung des Alphastrahlers Bismut-213 in normalen und malignen B-Zellen untersucht. Hierfür kamen die maligne Non-Hodgkin-Lymphom-Zell-Linie Karpas 422 sowie nicht maligne primäre, immunmagnetisch angereicherte CD19+ Zellen aus dem peripheren Blut zum Einsatz. Für den Transport und die Bindung des Strahlers diente der monoklonale Antikörper Rituximab, dessen Ziel das CD20 Antigen auf malignen und normalen B-Zellen darstellt. Mit den bestrahlten Zellen wurden sowohl Genexpressionsprofile mit Hilfe von Affymetrix Oligonukleotid-Arrays erstellt, die insgesamt 8.793 Gene abdecken, als auch funktionelle Untersuchungen zu DNA-Schäden und -Methylierung, Zellzyklus und Apoptose durchgeführt. Im Vergleich zu unbestrahlten Zellen zeigten die bestrahlten K422 Zellen bei einer applizierten Aktivität von 200 µCi 50 deregulierte Gene nach einer Expositionszeit von 46 Minuten (eine Halbwertszeit des Strahlers) und 485 differentiell regulierte Gene nach einer Bestrahlungsdauer von 24 Stunden (für 100 µCi: 42 Gene nach 46 min; 451 Gene nach 24 h). Eine starke strahlungsinduzierte Antwort konnte damit erst nach 24 Stunden beobachtet werden. Bei den CD19+ Zellen zeigten sich nach 46 Minuten 67 Gene bei einer Aktivität von 200 µCi dereguliert (100 µCi: 42 differentiell regulierte Gene). Mit Hilfe von Clusteranalysen war eine einheitliche Veränderung der Genexpressionsmuster der bestrahlten Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Proben nachweisbar. Alpha-bestrahlte Zellen zeigten eine transkriptionelle Aktivierung von DNA-Reparaturgenen. Konsistent mit diesem Befund konnten DNA-Schäden in Form von Doppelstrangbrüchen über H2AX in beiden Zelltypen nachgewiesen werden. In der Zell-Linie fiel weiterhin eine genomweite Demethylierung der DNA auf, die im Zusammenhang mit DNA-Läsionen einen Hinweis auf genomische Instabilität gibt. Ferner wurden in den K422 Zellen und den CD19+ Zellen zumeist hochregulierte Gene der allgemeinen und oxidativen Stressantwort gefunden. Überraschenderweise konnte in der Zell-Linie mit der transkriptionellen Aktivierung von Interferon-stimulierten Genen immunologische Aktivitäten beobachtet werden, die auf Proteinebene über die verstärkte Expression der Oberflächenantigene CD1c und CD164 sowie über die gesteigerte Sekretion der Zytokine TNFα, CCL3, CCL4 und IL8 bestätigt werden konnten. Eine immunologische Reaktion wurde auch in den normalen CD19+ Zellen über vermehrte Zytokinsekretion beobachtet. Die in den K422 Zellen beobachtete transkriptionelle Aktivierung von G1-S regulierenden Zellzyklusgenen sowie die verstärkte Proteinexpression des G1-S regulierenden Cyclins E2 lassen eine Progression in die S-Phase und einen Arrest in der S- oder G2/M-Phase vermuten. Diese Vermutung wird verstärkt durch die Ergebnisse der Zellzyklusanalysen und durch die komplette Hemmung des klonogenen Wachstums nach Bestrahlung. Im Gegensatz dazu zeigten die CD19+ Zellen mit der Aktivierung von Zellzyklusinhibitoren typische, bereits bekannte Reaktionen auf ionisierende Strahlung. Obwohl deregulierte Apoptose-assoziierte Gene in den Genexpressionsanalysen gefunden wurden, konnte keine Apoptose in den K422 Zellen nachgewiesen werden, was möglicherweise an einem verkürzten und damit funktionsunfähigen P53 Protein in den K422 Zellen lag. Die bestrahlten K422 Zellen sterben vermutlich durch Nekrose ab, scheinen jedoch trotz der schwerwiegenden zytotoxischen Schäden, die auf der Basis der Genexpressionsanalysen vermutet werden können, in der Lage zu sein, sämtliche verfügbare Abwehr- und Überlebensmechanismen aktivieren zu können. Damit zeigen die malignen Zellen etwas andere, auf Basis der Genexpressionsanalysen aber auch vielfältigere Reaktionen als die primären CD19+ Zellen. Dies liegt sicherlich nicht zuletzt an der tumorigenen Transformation der malignen Zellen, die damit über erheblich wirkungsvollere Verteidigungsmechanismen verfügen, als die primären CD19+ Zellen. Die Balance zwischen therapeutisch wirksamen Strahlungsdosen bei malignen Zellen und schädigenden Strahlungsdosen bei normalen Zellen ist daher ein wesentlicher Aspekt bei einer Radioimmuntherapie mit Alphastrahlung und klinisch von erheblicher Relevanz. The targeted delivery of radioisotopes with a high linear energy transfer and a short path length like alpha emitters directly to tumour cells by using monoclonal antibodies has become a promising concept for the treatment of cancer diseases. Because little is known about the biological effects of alpha radiation we examined the molecular effects of the alpha emitter Bismut-213 in malignant and normal B-cells. In this study, we used the cell line Karpas 422 which had been derived from a malignant B-cell Non-Hodgkin’s lymphoma as well as normal primary CD19+ B-cells which had been selected immunomagnetically from peripheral blood. For the delivery and binding of the alpha emitter we used the monoclonal antibody rituximab which targets the CD20 receptor of malignant and normal B-cells. We performed genome-wide expression analyses with untreated and irradiated K422 and normal CD19+ cells using Affymetrix oligonucleotide arrays covering 8.793 genes. In addition, we accomplished functional analyses to assess DNA repair and methylation, cell cycle alterations and apoptosis. Compared to the untreated cells K422 cells irradiated with 200 µCi showed 50 differential expressed genes after 46 minutes (one half life time) and 485 deregulated genes after exposure of 24 hours (for 100 µCi: 42 genes after 46 min; 451 genes after 24 h). Hence, a severe radiation induced response could not be detected before 24 hours. Irradiated CD19+ cells showed 67 differentially expressed genes after 46 minutes compared to the untreated CD19+ cells (for 100 µCi: 42 differentially expressed genes). By performing cluster analyses the irradiated cells exhibited a distinct homogenous molecular phenotype in comparison to not irradiated cells. Alpha irradiated cells showed transcriptional activation of DNA repair genes which is consistent with the finding of DNA damage proven by the phosphorylation of the histone protein H2AX which indicates DNA double strand breaks. In addition, genome wide DNA demethylation was found in K422 cells which gives in this context a hint to genomic instability. Furthermore, both examined cell types showed up-regulated genes which are known to play a role in general and oxidative stress response. Surprisingly, we found up-regulation of interferon-stimulated genes in K422 cells as well as increased protein expression of the surface antigens CD1c and CD164. Together with rising secretion of the cytokines TNFα, CCL3, CCL4 and IL8 these findings led to the assumption that the irradiated K422 cells exhibit some kind of immunological response. Secretion of these cytokines in the CD19+ cells confirmed weak radiation-induced immunological activities in primary cells as well. Because of the transcriptional activation of genes regulating the G1-S- cell cycle transition and the increased protein expression of cyclin E2 the supposition came up that the irradiated K422 do progress into the S-phase of the cell cycle and arrest in the S- or G2/M-phase. This assumption was corroborated by cell cycle analyses as well as by the inhibition of clonogenic growth following irradiation. In contrast to the K422 cells CD19+ cells revealed transcriptional activation of cell cycle inhibitors, which is an already known reaction following ionizing radiation. Although apoptosis associated genes were found to be differentially expressed no apoptosis-mediated cell death could be observed. In the course of this study we found a truncated P53 protein which probably contributed to the non-apoptotic behaviour in K422 cells. Alpha irradiated K422 cells presumably die by necrosis. In spite of the massive cytotoxic damages which are assumed referring to the gene expression data the K422 cells appear to be able to activate several defense mechanisms in a precise manner. Hence, the malignant K422 cells exhibit a larger amount as well as more various responses than the CD19+ cells. This might be due to the tumorigenic transformation of the malignant cells that exhibit probably more effective defense strategies than the CD19+ cells. The balance between the therapeutic effect of alpha radiation on malignant cells and the damaging effect on normal cells is an essential issue and it is of important clinical relevance concerning radioimmunotherapy with alpha radiation.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	02.07.2007
Dateien geändert am:	02.07.2007
Promotionsantrag am:	02.03.2007
Datum der Promotion:	23.05.2007