Dokument: Charakterisierung der PSD93 Expression in Interferon β-produzierenden plasmazytoiden dendritischen Zellen auf mRNAund Proteinebene
| Titel: | Charakterisierung der PSD93 Expression in Interferon β-produzierenden plasmazytoiden dendritischen Zellen auf mRNAund Proteinebene | |||||||
| Weiterer Titel: | Characterization of PSD-93 expression in interferon β-producing plasmacytoid dendritic cells on mRNA and protein level | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=50346 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20190730-090936-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Hoven, Alexander [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Scheu, Stefanie [Gutachter] Professor Aktas, Orhan [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | PSD93, plasmazytoide dendritische Zellen, Interferon beta, alternatives Spleißen | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | In vorausgehenden Arbeiten konnte in einer Transkriptom-Analyse von ex vivosortierten
plasmazytoiden dendritischen Zellen (pDCs) aus der Milz gezeigt werden, dass PSD93 (Postsynaptic density protein 93) stark differenziell von Interferon (IFN) β produzierenden pDCs gegenüber pDCs exprimiert wird, die kein IFNβ produzieren. PSD93 ist aus den Neurowissenschaften u.a. zur Stabilisierung von Glutamatrezeptoren in der postsynaptischen Membran bekannt, und im Mausmodell konnte die Relevanz für komplexe kognitive Leistungen wie Lernen und Gedächtnis gezeigt werden. Das Vorkommen und die Hochregulation von Psd93 nach Stimulation in pDCs war überraschend, da bislang keine Funktion in Immunzellen beschrieben war. Diese Arbeit charakterisiert PSD93, welches in pDCs und anderen Immunzellen vorkommt, auf mRNA- und Proteinebene. Im Fokus dieser Arbeit stehen die unterschiedlichen Spleißvarianten von Psd93. Als Ausgangsmaterial dienten Knochenmark(KM)-differenzierte FMS-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3L) Kulturen aus IFNβ-Reportermäusen, die nach Stimulation mit CpG über die Expression von yellow fluorescent protein (YFP) in IFNβ/YFP+ und IFNβ/YFP- Dendritische Zellen (DCs) FACS-sortiert wurden. Mit konventioneller RTPCR wurde die Expression von Psd93-Transkripten überprüft und durch Sequenzierung bestätigt. Die qRT-PCR stellte die differenzielle Expression von Psd93 in YFP+ im Vergleich zu YFP- DCs dar. Vorrangig wurde die Expression in pDCs untersucht, jedoch konnten Teile der Versuche auch an Material aus konventionellen DCs und Makrophagen durchgeführt werden. Anschließend sollten PSD93-Protein-Isoformen mittels Immunpräzipitation und Western-Blot gezeigt werden. Im Vorfeld führten wir eine Datenbankrecherche durch, was zur Etablierung einer modifizerten Gen-Nomenklatur für Psd93 führte. Diese diente als Ausgangspunkt zur Einordnung der amplifizierten Psd93-Transkripte. Die Expressionssteigerung von Psd93 konnte für in vitro Flt3L-Kulturen bestätigt werden. Als einziges Transkript ließ sich die γ-Isoform mit der RT-PCR darstellen. In einem parallel durchgeführten 5´RACE-PCR-Ansatz wurde mit einem kürzeren η-Transkript eine weitere N-terminale Isoform amplifiziert. In einem Bereich alternativen Spleißens ergaben sowohl RT-PCR als auch RACE-PCR dieselbe vom Spleißverhalten in Neuronen abweichende Exon-Sequenz mit Exon 18-19-20-23 und der Abwesenheit von Exon 21 und 22 in Transkripten aus pDCs. Zusammenfassend lässt sich von einem pDC-spezifischen Spleißmuster sprechen. Auf Proteinebene konnte die genannte γ- und η-Isoform von PSD93 durch Größenvergleich mit überexprimierten Protein-Isoformen gezeigt werden. Die in den Neurowissenschaften genutzte PSD93-/- Maus stellt keinen vollständigen Knockout für die kurze η-Isoform dar, welche von uns auch in Proben aus Gehirn detektiert werden konnte. Für unsere Zwecke wurde die Nomenklatur dahingehend auf PSD93Δ9/Δ9 geändert. Zur weiteren Untersuchung der Funktion der η-Variante von PSD93 erscheint die Generierung eines vollständigen Knockout-Modells notwendig.In previous studies using transcriptome analysis of ex vivo sorted plasmacytoid dendritic cells (pDCs) from the spleen it was shown, that PSD93 (Postsynaptic density protein 93) is highly differentially expressed in Interferon (IFN) β-producing pDCs vs. pDCs not producing this cytokine. PSD93 is known from neuroscience where it i.a. stabilizes glutamate receptors in the postsynaptic membrane and in the mouse its relevance for complex cognitive functions such as learning and memory could be displayed. The existence and upregulation of Psd93 after stimulation in pDCs was surprising, because no function for this protein was described in immune cells, so far. This thesis characterizes PSD93 expression in pDCs and other immune cells on mRNA and protein level. The focus of this thesis lies on the Psd93 splice variants. As starting material served bone marrow-derived FMS-like tyrosine kinase 3 ligand (Flt3l) cultures from IFNβ reporter mice which were FACS-sorted for the expression of yellow fluorescent protein (YFP) into IFNβ/YFP+ and IFNβ/YFPdendritic cells (DCs) after stimulation with CpG. The expression of Psd93 transcripts was checked with conventional RT-PCR and confirmed through sequencing. qRTPCR illustrated the differential expression of Psd93 in YFP+ compared to YFP- DCs. The primary goal was the examination of the expression in pDCs, however additional experiments could be performed with material from conventional DCs and macrophages. After that, PSD93 protein isoforms were analysed through immunoprecipitation and Western blotting. We have previously performed a database analysis that established a modified gene nomenclature for Psd93 which was used as reference for the integration of our amplified transcripts. The increased expression of Psd93 could be confirmed for in vitro Flt3l cultures. Only the γ-isoform could be found as transcript by RT-PCR. The 5´RACE-PCR performed in parallel could amplify a shorter η-transcript as an additional N-terminal isoform. In a gene area of alternative splicing both RT-PCR as well as RACE-PCR showed the same splicing pattern with the exon sequence 18- 19-20-23 and the absence of exon 21 and 22 in transcripts from pDCs which is different from neurons. In conclusion, a pDC-specific splicing pattern was established. On protein level, the already described γ- and η-isoforms of PSD93 could be shown through size comparison of the overexpressed protein. The PSD93-/- mouse used in neuroscience so far is not a full knockout for the short η-isoform which we also detected in material taken from brain. For our purposes the nomenclature for this mouse was changed to PSD93Δ9/Δ9. For future investigations of the functional role of PSD93η-variant the generation of a full knockout is necessary. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Medizinische Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 30.07.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 30.07.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 11.02.2019 | |||||||
| Datum der Promotion: | 25.07.2019 |
