Dokument: Adaptation der Screening-PCR für Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) zur Detektion regionaler MRSA-Varianten - Evaluation neuer Primer

Titel:	Adaptation der Screening-PCR für Methicillin-resistenten Staphylococcus aureus (MRSA) zur Detektion regionaler MRSA-Varianten - Evaluation neuer Primer
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=50057
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190701-084241-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Herma, Miriam [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 814,4 KB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 28.06.2019 / geändert 28.06.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Henrich, Birgit [Gutachter] Priv.-Doz. Dr. Meller, Stephan [Gutachter]
Stichwörter:	MRSA, Screening-PCR
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Der Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) ist ein weltweit verbreiteter Problemkeim. Er verursacht grundsätzlich die gleichen Krankheitsbilder wie der Methicillin-sensible S. aureus, jedoch konnte gezeigt werden, dass sowohl Morbidität als auch Mortalität bei MRSA-Trägern und -Infizierten erhöht sind, wodurch zusätzlich höhere Behandlungskosten entstehen. Zur Senkung der MRSA-Prävalenz wurden in vielen Ländern nationale Überwachungsprogramme etabliert. Diese verwenden u.a. molekularbiologische Methoden, wie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), zur Reihenuntersuchung von Risikopatienten bei Krankenhausaufnahme, um bei MRSA-Trägern frühzeitig Maßnahmen zur Prävention einer Transmission ergreifen zu können. Im Jahr 2004 beschrieben Huletsky et al. eine innovative MRSA-Screening-PCR, welche sich durch die Amplifikation der SCCmec-orfX-junction auszeichnete und erstmals für die Testung von polymikrobiellem Material geeignet war. Dieses PCR-Verfahren wurde am Institut für Medizinische Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf im Jahr 2006 eingeführt. Im Laufe der Zeit verschlechterte sich die Sensitivität dieser PCR jedoch aufgrund einer zunehmenden Anzahl an neuen MRSA-Varianten. Das Ziel dieser Arbeit lag darin, den Nutzen von 17 neuen MRSA-Primern, die von van der Zee et al. 2011 publiziert worden waren, für den Nachweis der neuen MRSA-Varianten aus dem Großraum Düsseldorf zu untersuchen und eine erweiterte MRSA-Screening-PCR mit verbesserter Sensitivität zu etablieren. Hierzu wurden 290 Proben mit falsch-negativem PCR-Ergebnis (aber MRSA-positiver Kultur) und 380 Proben der Routinediagnostik mithilfe der neuen Primer untersucht. Zusätzlich wurde ein MRSA-Primer entwickelt (Primer FC), welcher den mecC-tragenden, neu beschriebenen SCCmec-Typ XI detektieren sollte. Der Primer wurde anschließend in die Screening-PCR integriert und diese validiert. Die Sequenzierung von 179 PCR-Produkten zeigte, dass neun der 17 Primer hiesige MRSA-Varianten detektieren konnten, wobei die vier Primer F13 (n = 76), F11 (n = 6), F14 (n = 15) und F25 (n = 8) bereits für 85,4% (105/123) der Ergebnisse verantwortlich waren und deshalb in die verbesserte MRSA-Screening-PCR integriert wurden. In der Validierung der verbesserten MRSA-Screening-PCR wurden 71 MRSA-Isolate vom SCCmec-Typ I-VI, 50 MSSA-Isolate und 100 Abstrichproben getestet. Die Sensitivität konnte von 93% auf 98,6% gesteigert werden, wobei die restlichen Gütekriterien des Tests unbeeinflusst blieben. Ebenso zeigte der neu entwickelte Primer FC innerhalb der Screening-PCR in der Validierung eine Sensitivität und Spezifität von jeweils 100%. BLAST-Analysen ließen vermuten, dass durch die erweiterte PCR die SCCmec-Typen I-XI, inklusive CA- und LA-MRSA detektiert werden können. Diese Arbeit demonstriert ein experimentelles Vorgehen zur Anpassung der MRSA-Screening-PCR an MRSA-Varianten, die neu im Großraum Düsseldorf aufgetreten sind. Sie zeigt somit eine methodische Vorgehensweise auf, mit der die Diagnostik an jedwede Region mit darin vorkommenden MRSA-Varianten angepasst werden kann. Methicillin-resistant S. aureus is known to be a worldwide microbial problem. Eventhough it causes the same array of diseases as Methicillin-sensitive S. aureus, both morbidity and mortality are increased in MRSA-carriers and in patients with clinical manifestation of an MRSA-infection. As a result, MRSA is a significant contributor to the increase of health-care expenses. In order to keep the spread of MRSA under control, many countries have established national active surveillance programs. Among other actions, these programs use molecularbiological methods like polymerase-chain-reaction (PCR) to screen at-risk patients right when admitted to a hospital. Thus, by quickly identifying MRSA-carriers, preventive measures can be taken to avoid the transmission within the healthcare facility. In 2004, Huletsky et al. described an innovative MRSA-Screening-PCR which featured the amplification of the SCCmec-orfX-junction and could be used to test polymicrobial material. This PCR-method has also been implemented at the institute for medical microbiology and hospital hygiene at the Heinrich-Heine-University Düsseldorf in 2006. However, as the number of MRSA-variants increased over time, the sensitivity of the PCR decreased respectively. The goal of this study was to examine 17 new forward primers, published by van der Zee et al. in 2011, and to evaluate their usefulness for the detection of novel MRSA-variants in the region of Düsseldorf in order to establish an extended Screening-PCR with an increased sensitivity. To achieve that goal, 290 screening-samples with false-negative PCR-results (proven to contain MRSA by microbial culture) and 380 samples out of routine diagnostics were tested using these new primers. Furthermore, a new forward primer has been developed, which was supposed to detect the recently described mecC-carrying SCCmec-type XI. This primer (FC) was then integrated into the Screening-PCR and validated. The sequencing of 179 PCR-products showed that 9 out of 17 primers were able to detect local MRSA-variants. The four most frequently used primers were responsible for 85.4% (105/123) of the results (F13 (n = 76), F11 (n = 6), F14 (n = 15) and F25 (n = 8)) and were integrated into the Screening-PCR. For validation, 71 MRSA-isolates (SCCmec-Type I-VI), 50 MSSA-isolates und 100 swab samples were tested. We saw an increase in sensitivity from 93% to 98.6%, whereas the other criteria of test quality where unaffected. Besides, both sensitivity and specificity of the newly developed FC primer were at 100% within the Screening-PCR. BLAST-analysis suggested that SCCmec-types I-XI can be detected by the supplemented PCR, including CA-MRSA and LA-MRSA. This work demonstrates an experimental approach of adjusting the MRSA-Screening-PCR to MRSA-variants which newly occurred in the greater area of Düsseldorf. Thereby, it shows a methodological procedure by which diagnostics can be modified according to any regional MRSA-variants.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Medizinische Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	01.07.2019
Dateien geändert am:	01.07.2019
Promotionsantrag am:	20.11.2018
Datum der Promotion:	27.06.2019