Dokument: Regulation and assembly of the cytochrome bc1-aa3 supercomplex in Corynebacterium glutamicum

Titel:	Regulation and assembly of the cytochrome bc1-aa3 supercomplex in Corynebacterium glutamicum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=49936
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190626-111130-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M.Sc. Davoudi, Cedric-Farhad [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 23,32 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.06.2019 / geändert 18.06.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The synthesis of aerobic respiratory chains requires cofactors such as heme and copper and chaperones involved in the biogenesis of the enzyme complexes. The Gram-positive soil bacterium Corynebacterium glutamicum possesses a branched aerobic respiratory chain comprising, besides several dehydrogenases reducing menaquinone to menaquinol, a copper-dependent cytochrome bc1-aa3 supercomplex and cytochrome bd quinol oxidase. The cytochrome bc1-aa3 supercomplex is characteristic for aerobic Actinobacteria and the major generator of proton-motive force, but knowledge on its assembly or regulation is very limited. In this thesis, assembly factors involved in copper and heme insertion and regulatory proteins involved in expression control of respiratory chain components were identified and characterized. The following results were obtained: (i) Identification of the copper-deprivation stimulon led to the discovery of the two proteins Cg2699 (copper transport and insertion protein, CtiP) and Cg1884 (CopC). CtiP contains 16 predicted transmembrane helices and shows sequence similarity to the copper-transporter CopD and the cytochrome biogenesis chaperone CtaG. Deletion of ctiP resulted in a strong growth defect in standard glucose minimal medium (CGXII) resembling a cytochrome aa3 oxidase-deficient strain. Furthermore, the ΔctiP strain exhibited an increased copper-tolerance, suggesting a copper-transporting function. Transcriptome analysis revealed an induction of the copper-deprivation stimulon in the ΔctiP strain under copper sufficiency. CopC is a secreted protein with a C-terminal transmembrane helix and harbors a Cu(II)-binding site. Deletion of copC resulted in a growth defect in BHI complex medium and improved growth under copper excess, also suggesting an involvement in copper-transport. The lack of either CtiP or CopC prevented co-purification of the subunits of the supercomplex, indicating a crucial role of both CtiP and CopC in the correct assembly of the supercomplex. (ii) The search for further assembly factors of the bc1-aa3 supercomplex led to the discovery of Cg2460, a homologue of the heme a insertion chaperone Surf1. Loss of Surf1 caused a strong growth defect, comparable to the ΔctiP strain, which could be complemented by several actinobacterial Surf1 homologues. Furthermore, the Δsurf1 strain exhibited an increased copper sensitivity. Cytochrome measurements showed a reduction of cytochromes c and a, but an increase of cytochrome d. Analysis of membranes of the Δsurf1 strain revealed the complete loss of cytochrome c oxidase activity. Lack of Surf1 prevented co-purification of the subunits of the supercomplex, indicating a crucial role in the correct assembly of the supercomplex. Transcriptome analysis revealed an induction of the copper-deprivation stimulon in the Δsurf1 strain, suggesting an intertwined regulation of copper and heme homeostasis. (iii) To assess the global cellular response towards heme, a genome-wide target profiling of the heme-sensing two-component system HrrSA was performed. Time-resolved ChAP-Seq analyses to follow DNA-binding by the response regulator HrrA encoded on a plasmid was coupled with time-resolved RNA-Seq analyses comparing a ΔhrrA strain with the wild type. This approach revealed 272 affected genes upon a 4 μM heme pulse under iron-starvation conditions. These targets include genes encoding proteins involved in heme biosynthesis, oxidative stress, cell envelope remodeling and the respiratory chain. Furthermore, HrrA-mediated repression of sigC, encoding the extracytoplasmic function sigma factor σC, which activates the cytochrome bd oxidase genes, leads to prioritised heme distribution to the cytochrome bc1-aa3 branch under heme sufficiency. Die Synthese aerober Atmungsketten erfordert Kofaktoren wie Häm und Kupfer sowie Chaperone, die an der Biogenese der Enzymkomplexe beteiligt sind. Das Gram-positive Bodenbakterium Corynebacterium glutamicum besitzt eine verzweigte aerobe Atmungskette, die neben mehreren Dehydrogenasen, die Menachinon zu Menachinol reduzieren, einen kupferabhängigen Cytochrom bc1-aa3-Superkomplex und eine Cytochrom bd-Chinoloxidase umfasst. Der Cytochrom bc1-aa3-Superkomplex ist für aerobe Actinobakterien charakteristisch und der Hauptgenerator der Protonen-motorischen Kraft. Das Wissen über dessen Assemblierung und Regulation ist sehr begrenzt. In dieser Arbeit wurden Assemblierungsfaktoren, die an der Insertion von Kupfer und Häm beteiligt sind, sowie regulatorische Proteine, die an der Expressionskontrolle von Komponenten der Atmungskette beteiligt sind, identifiziert und charakterisiert. Dabei wurden folgende Ergebnisse erzielt: (i) Die Identifikation des Kupfermangel-Stimulons führte zur Entdeckung der beiden Proteine Cg2699 (copper transport and insertion protein, CtiP) und Cg1884 (CopC). CtiP enthält 16 vorhergesagte Transmembranhelices und weist Sequenzähnlichkeit zu dem Kupfer-Transporter CopD aus Pseudomonas syringae und dem Cytochrom-Biogenese-Chaperon CtaG aus Bacillus subtilis auf. Eine Deletion von ctiP resultierte in einem starken Wachstumsdefekt in Standard-Glukose-Minimal-Medium (CGXII), welcher dem eines aa3-Oxidase-defizienten Stamm ähnelte. Darüber hinaus wies der ΔctiP-Stamm eine erhöhte Kupfertoleranz auf, was auf eine Kupfer-transportierende Funktion hindeutet. Eine Transkriptom-Analyse offenbarte die Induktion des Kupfer-Mangel-Stimulons im ΔctiP-Stamm trotz eines ausreichenden Kupfergehaltes im Medium. CopC ist ein sekretiertes Protein mit einer C-terminalen Transmembranhelix und besitzt eine Cu(II)-Bindestelle. Deletion von copC führte zu einem Wachstumsdefekt in BHI-Komplexmedium und verbessertem Wachstum unter Kupferstress, was ebenfalls auf eine Beteiligung am Kupfertransport hindeutet. Das Fehlen von CtiP oder CopC verhinderte die Ko-Aufreinigung von bc1-aa3-Supercomplex-Untereinheiten, was auf eine wichtige Rolle von CtiP und CopC bei der korrekten Assemblierung des Supercomplexes hindeutet. (ii) Die Suche nach weiteren Biogenese-Chaperonen führte zur Identifizierung von Cg2460, einem Homolog des Häm-a-Insertions-Chaperons Surf1 aus Paracoccus denitrificans. Der Verlust von Surf1 führte zu einem starken Wachstumsdefekt in C. glutamicum, vergleichbar mit einem ΔctiP-Stamm, welcher durch verschiedene aktinobakterielle Surf1-Homologe komplementiert werden konnte. Zudem wies der Δsurf1-Stamm eine erhöhte Kupfersensitivität auf. Messungen der Cytochrome zeigten eine Reduktion von Cytochrom c und a, jedoch eine Erhöhung von Cytochrom d. Analysen von Membranen des Δsurf1-Stamms zeigten den kompletten Verlust der Cytochrom c-Oxidase-Aktivität. Das Fehlen von Surf1 verhinderte die Ko-Aufreinigung der Untereinheiten des bc1-aa3-Superkomplexes, was auf eine wichtige Rolle bei der korrekten Assemblierung hindeutet. Eine Transkriptom-Analyse ergab die Induktion des Kupfer-Mangel-Stimulons im Δsurf1-Stamm, was für eine Kopplung von Häm- und Kupfer-Homöostase spricht. (iii) Um die globale zelluläre Häm-Antwort zu charakterisieren, wurde eine Genom-weite Zielgen-Untersuchung des Häm-wahrnehmenden Zwei-Komponenten-Systems HrrSA durchgeführt. Zeitaufgelöste ChAP-Seq-Analysen zur Analyse der DNA-Bindung durch den auf einem Plasmid kodierten Antwortregulator HrrA wurden mit zeitaufgelösten RNA-Seq-Analysen gekoppelt, bei denen ein ΔhrrA-Stamm mit dem Wildtyp verglichen wurde. Dieser Ansatz offenbarte 272 beeinflusste Zielgene als Antwort auf einen 4 μM Häm-Puls unter Eisen-Mangel-Bedingungen. Die durch diese Zielgene kodierten Proteine sind beteiligt an der Häm-Biosynthese, an der Antwort auf oxidativen Stress, an der Remodellierung der Zellhülle sowie an der Atmungskette. Darüber hinaus führt die HrrA-vermittelte Repression von sigC, das für den extracytoplasmic function σ factor σC kodiert, der u.a. die Expression der Cytochrom bd-Oxidase-Gene aktiviert, zu einer Priorisierung der Häm-Verteilung in Richtung des Cytochrom bc1-aa3-Zweigs der Atmungskette bei ausreichender Häm-Versorgung.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	26.06.2019
Dateien geändert am:	26.06.2019
Promotionsantrag am:	28.02.2019
Datum der Promotion:	16.05.2019