Dokument: Studie oxidativer Veränderungen während der neuronalen Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen mithilfe der Proteomanalyse
| Titel: | Studie oxidativer Veränderungen während der neuronalen Differenzierung von SH-SY5Y-Zellen mithilfe der Proteomanalyse | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=49706 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20190603-091407-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Brenig, Katrin [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Stühler, Kai [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Ein gängiges Modellsystem um initiale Prozesse der neuronalen Differenzierung zu untersuchen, ist die humane Neuroblastom-Zelllinie SH-SY5Y. Obwohl die durch Retinsäure induzierten Vorgänge zunehmend mit redox-sensitiven Prozessen in Verbindung gebracht werden, sind die molekularen Auswirkungen auf die Proteine nicht vollständig aufgeklärt. In dieser Arbeit wurde daher der Einfluss von oxidativen Veränderungen während der frühen Zeitpunkte der neuronalen Differenzierung des Zellmodells mithilfe der Proteomanalyse unter¬sucht.
Infolge des angewandten Differenzierungsprotokolls kommt es zu einer signifikanten Extension der Neuriten, einem phänotypischen Merkmal des neuronalen Differenzierungsprozesses. Mittels quantitativer Massenspektrometrie wurden zwei Proteomanalysen durchgeführt, welche die differenziellen Proteinabundanzen in einem dynamischen Verlauf zwischen 0 - 48 Std. und nach 120 Std. darstellen. Dadurch konnten veränderte Abundanzen von Marker¬proteinen nachgewiesen werden, die am Retinsäure-Signalweg (z.B. CRABP2) und der neuronalen Differenzierung (z.B. RET) beteiligt sind. Unterstützt wurden diese Ergebnisse durch quantitative mRNA Daten. Einhergehend mit der größten morphologischen Veränderung nach 48 Std. legen auch die Proteomanalysen nahe, dass die Zellen von einem proliferierenden in einen differenzierenden Zustand übergehen. Die, mithilfe von redox-sensitiven Sensoren (RoGFP2), durch¬geführten Experimente weisen schließlich auf einen signifikanten Anstieg von zytosolischen H2O2 nach zweistündiger Retinsäure¬behandlung hin, an dem wahr¬scheinlich eine Aktivität des NADPH-Oxidase-Komplexes-2 beteiligt ist. Für die globale Analyse von reversibel oxidierten Proteinen wurde ein redox-spezifisches Protein¬anreicherungs¬protokoll etabliert, welches einen Nachweis mittels quantitativer Massenspektrometrie ermöglichte. Während zwischen 0 - 3 Std. nur < 0,5% der Proteine eine Veränderung in der Abundanz aufwiesen, zeigten im Redox-Proteom nach 2 Std. Retinsäurebehandlung 275 (16%) der 1 769 quantifizierten cysteinhaltigen Proteine signifikante Unterschiede. Darunter solche mit bereits bekanntem Bezug zu redox-sensitiven Prozessen und/oder der neurologischen Entwicklung (z. B. RAC1). Für 57 dieser 275 Proteine lieferten die Ergebnisse zudem Informationen über die potenziell reversibel oxidierten Cysteine. Schließlich wurde gezeigt, dass eine Veränderung des zellulären Redox¬zustandes, durch Zugabe des Reduktionsmittels N-Acetylcystein oder des Radikalfängers Butylhydroxyanisol, sowohl Auswirkungen auf die Abundanz von Markerproteinen hat als auch zu signifikant verkürzten Neuriten¬ führt. Dieses Experiment ist ein weiterer Hinweis darauf, dass zelluläre Redox¬prozesse an der neuronalen Differenzierung des Zellmodells beteiligt sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Modelle vorgeschlagen, die die molekularen Auswirkungen veränderter ROS-Mengen erklären. (1) ROS sind Teil des Auto¬regulations¬mechanismus mit dem die zelluläre Retinsäure-Homöostase kontrolliert wird. (2) Ein frühzeitiger ROS-Anstieg führt zu gezielten oxidativen Modifizierungen an Proteinen downstream des klassischen Retinsäure-Signalweges. Potenziell redox-sensitive Proteine können dabei Teile von Signal¬kaskaden sein, die auf veränderte energetische Bedürfnisse der neuronal differenzierenden Zelle reagieren und zu der Ausbildung phänotypischer Merkmale beitragen können.The human neuroblastoma cell line SH-SY5Y is a common model system to study the initial phases of neuronal differentiation. Although the progression induced by retinoic acid is increasingly associated with redox-sensitive processes, the molecular effects on proteins are not fully elucidated. Here, the influence of oxidative changes during the early stages of neuronal differentiation was investigated using proteome analysis. The applied differentiation protocol results in neurite outgrowth, a characteristic event of the neuronal differentiation process. Using quantitative mass spectrometry-based proteomics changes in protein abundance were analyzed in a dynamic time course between 0 - 48 h and after 120 h. In combination with quantitative mRNA data, changes in marker proteins involved in the retinoic acid signaling pathway (e.g. CRABP2) as well as neuronal differentiation (e.g. RET) were detected. Along with the largest morphological change within 48 h, proteome analyzes indicates a cellular change from proliferation to differentiation. Subsequently, experiments with redox-sensitive sensors (RoGFP2) indicate a significant increase in cytosolic H2O2 after 2 h of retinoic acid treatment, probably involving the activity of the NADPH oxidase-2 complex. A redox-specific protein enrichment protocol was established to facilitate the global analysis of reversibly oxidized proteins by quantitative mass spectrometry. While only < 0.5% of the proteins showed a change in abundance between 0 - 3 h, the analysis of the redox proteome revealed profound changes after 2 h of treatment. Out of 1 769 quantified cysteine containing proteins, 275 showed a significant difference between retinoic acid treated and control cells. Among these are proteins with known connections to redox-sensitive processes and/or neurological development (e.g. RAC1). Furthermore, the results provided valuable hints about the reversibly oxidized cysteines for 57 of these 275 proteins. Finally, the addition of reducing agent N-acetylcysteine or the free radical scavenger butylated hydroxyanisole let to a change in the cellular redox state, affected the abundance of marker proteins and reduced the neurite elongation. This experiment is another indication that the cellular redox state is important for the neuronal differentiation of the model. Based on the data obtained in this thesis, two models were proposed explaining the molecular effects of altered ROS levels. (1) ROS are part of the autoregulatory mechanism by which cellular retinoic acid homeostasis is controlled. (2) An early increase in ROS leads to targeted oxidative modifications of proteins downstream of the classical retinoic acid signaling pathway. Potentially redox-sensitive proteins can be part of signaling cascades that react according to altered energetic needs of neuronal differentiating cells and contribute to phenotypic characteristics. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 03.06.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 03.06.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 28.11.2018 | |||||||
| Datum der Promotion: | 02.05.2019 |
