Dokument: Relative Expression der microRNA-9, -26b, -34a und -103 im Spinalganglion der Ratte bei induziertem neuropathischen Schmerz und Ermittlung einer möglichen Interaktion zwischen microRNA-34a und der beta-2-Untereinheit eines spannungsgesteuerten Natriumkanals (SCN2B)

Titel:	Relative Expression der microRNA-9, -26b, -34a und -103 im Spinalganglion der Ratte bei induziertem neuropathischen Schmerz und Ermittlung einer möglichen Interaktion zwischen microRNA-34a und der beta-2-Untereinheit eines spannungsgesteuerten Natriumkanals (SCN2B)
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=49705
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190531-131715-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Johannsen, Laura [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,28 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.05.2019 / geändert 21.05.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Bauer, Inge [Gutachter] PD Dr. med. Kremer, David [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Neuropathische Schmerzen führen zu einer gesteigerten Schmerzsensation, erhöhtem Schmerzempfinden und Schmerzpersistenz. Die Pathomechanismen neuropathischer Schmerzen sind nicht vollends geklärt. Die Therapie ist aktuell lediglich symptomatisch orientiert und führt nur selten zu einem vollständigen Abklingen der Schmerzsymptomatik. Eine mögliche Schlüsselrolle in der Entstehung neuropathischer Schmerzen bilden microRNAs (miRs). MiRs sind kleine, nicht kodierende RNA-Moleküle, die über die Regulation der Translation Einfluss auf physiologische und pathologische Prozesse nehmen. Ziel dieser Arbeit war es, eine differentielle Expression von miRs, deren Interaktion mit schmerzrelevanten Targets und die Proteinexpression der Ziel-mRNA nach Induktion neuropathischer Schmerzen zu untersuchen. Durch die Detektion möglicher Pathomechanismen neuropathischer Schmerzen könnten potentielle Therapieansatzpunkte für weiterführende Studien ermittelt werden. Zur Induktion neuropathischer Schmerzen wurde eine Chronic Constriction Injury (CCI) bei männlichen Wistar-Ratten durchgeführt. Nach Randomisierung in zwei Gruppen (n = 24 pro Gruppe) erfolgte eine Freilegung des Nervus ischiadicus (N. ischiadicus). In einer Gruppe wurde der Nerv ligiert, in der zweiten Gruppe (Sham-Gruppe) wurde der Nerv nur freigelegt ohne Bindung der Ligaturen. Zu den Zeitpunkten 4 Stunden, 1 Tag, 6 Tage und 12 Tage nach Induktion der CCI bzw. Sham-OP erfolgte die Entnahme der Spinalganglien (DRG) L4 - L6. Zur Untersuchung der Expression der miRs mittels quantitativer Realtime-PCR (qPCR) erfolgte eine Auswahl von vier miRs, die sich in einem in unserer Arbeitsgruppe im Vorfeld durchgeführten miRNA Microarray differentiell exprimiert gezeigt hatten. In einer in-silico Analyse wurden mögliche schmerzrelevante Ziel-mRNAs ermittelt. Der Nachweis einer Interaktion einer miR mit der ausgewählten Ziel-mRNA erfolgte mittels Luziferase-Assay. Die relative Expression des Proteins der Ziel-mRNA im DRG wurde mittels Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) zum Zeitpunkt 12 Tage nach Induktion der CCI untersucht. Für die qPCR wurde die delta-delta-Ct Methode angewandt. Die statistische Überprüfung mit Berechnung der relativen Expressionsunterschiede und des Signifikanzniveaus erfolgte mit dem Programm REST (Version 2009). Die statistische Auswertung für den Luziferase-Assay und ELISA erfolgte mittels ungepaarten student’s t-test. Es wurde ein Signifikanzniveau von p < 0,05 angenommen. Die Untersuchungen der miR 34a ergaben eine signifikante Herunterregulation der miR 34a (fold change: 0,4, *p = 0,001) zwölf Tage nach Induktion der CCI. Die Auswertung der qPCR für miR 9, 26b und 103 ergaben keine signifikant veränderte Expression der jeweiligen miR. In der in-silico Analyse für miR 34a konnte die mRNA einer beta 2 Untereinheit eines spannungsgesteuerten Natriumkanals (SCN2B) ermittelt werden. Im Luziferase Assay wurde eine Bindung der miR 34a an die mRNA von SCN2B bestätigt. Im ELISA ergab sich keine relevant erhöhte relative Expression des Proteins SCN2B (vs Sham). Zusammenfassend führt die Induktion einer CCI nach zwölf Tagen zu einer signifikant verminderten Expression der miR 34a im DRG von männlichen Wistar-Ratten. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals die Bindung der miR 34a an die mRNA von SCN2B in-vitro bestätigt werden. Ein Effekt auf Proteinebene im DRG in-vivo im ELISA blieb aus. Es sind weitere Studien notwendig um die funktionelle Rolle der miR 34a und weiterer miRs in der Ausbildung und Persistenz neuropathischer Schmerzen zu untersuchen. Neuropathic pain is associated with increased nociception and persistence of symptoms. The underlying pathomechanisms are not completely understood. To date, therapy of neuropathic pain is oriented at symptom relief. A complete absence of pain is rarely achieved. The detection of the underlying pathomechanism would have a significant impact on the development of new therapeutic approaches. It has been previously suggested that microRNAs (miRs) play a key role in the pathogenesis of neuropathic pain. MiRs are small, non-coding RNA molecules that influence physiological and pathological processes through the regulation of translation. The aim of this study was to investigate the expression of miRs, their interaction with pain related targets in vitro and to examine the protein expression of the target mRNA in vivo after induction of neuropathic pain. In order to induce neuropathic pain, chronic constriction injury (CCI) was induced in male Wistar rats. Subsequently, the sciatic nerve was exposed. The rats were randomized in two groups (n = 24 per group). The first group received ligation, whereas in the second group (sham group) no ligation was performed. The dorsal root ganglia (DRG) L4 - L6 were removed at four different time points (4 hours, 1 day, 6 days, 12 days, n = 6 per group). In a previously performed miRNA microarray a differential expression of several miRs was detected at the indicated time points after induction of CCI. Four differentially expressed miRs were selected and further investigated in quantitative real-time PCR (qPCR). In in-silico analysis possible pain related target mRNAs were determined. We utilized a luciferase assay to show an interaction between the miR and the selected target mRNA. The relative expression of the target mRNA protein was examined in the DRG by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) twelve days after induction of CCI. The delta-delta-Ct method was used for the qPCR. Statistical analysis was performed with the REST program (version 2009). Differences among groups for the luciferase assay and ELISA were evaluated with the two-tailed student's t-test. The significance level was set at p < 0.05. The miR 34a analysis showed a significant down-regulation of miR 34a (fold change: 0.4, *p < 0.001) twelve days after induction of CCI compared to the control group. The qPCR for miR 9, 26b and 103 showed no significant change in the expression pattern. The in-silico analysis for miR 34a revealed the mRNA of a beta 2 subunit of a voltage-gated sodium channel (SCN2B). In the luciferase assay an interaction between miR 34a and the mRNA of SCN2B was confirmed. No significant expression of the protein SCN2B was demonstrated in the ELISA compared to the control group. In summary, 12 days after induction of CCI the expression of miR 34a is significantly reduced in DRGs of male Wistar rats. For the first time, an interaction of miR 34a with a mRNA of SCN2B was documented. There was no effect on the protein level in the spinal ganglion in vivo. Further studies are needed to investigate the functional role of miR 34a and other miRs in the development and persistence of neuropathic pain.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	31.05.2019
Dateien geändert am:	31.05.2019
Promotionsantrag am:	04.10.2018
Datum der Promotion:	10.04.2019