Dokument: Structural characterization of recombinant and pathogenic Amyloidβ(1-42)-Peptide by solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Titel:	Structural characterization of recombinant and pathogenic Amyloidβ(1-42)-Peptide by solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
Weiterer Titel:	Strukturelle Charakterisierung des rekombinanten und pathogenen Amyloidβ(1-42)-Peptids mit Festkörper-Kernspin-Resonanz-Spektroskopie
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=49595
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200609-100349-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schölzel, Daniel [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 24,26 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.05.2019 / geändert 13.05.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Heise, Henrike [Gutachter] Jun.-Prof. Dr. Schröder, Gunnar [Gutachter]
Stichwörter:	solid-state, NMR, amyloid, Alzheimer
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In der Entwicklung der Alzheimer’schen Demenz spielt die Produktion des aus 42 Aminosäuren bestehenden Peptids Amyloid β (Aβ(1-42)) eine wichtige Rolle. Aufgrund der Tatsache, dass es schneller aggregiert als das häufigere Aβ(1-40) und bei der erblichen Form der Erkrankung involviert ist, ist es von besonderem Forschungsinteresse. Veröffentlichte Studien zeigen den starken Einfluss dieser zwei zusätzlichen C-terminalen Aminosäuren auf die Aggregationskinetik, der Ausprägung unterschiedlicher Molekülgrenzflächen und einer veränderten Anordnung und Länge der β-Faltblätter in der Fibrille. In dieser kombinierten Cryo-EM und Festkörper-NMR Studie präsentieren wir die Fibrillenstruktur eines rekombinant-exprimierten Aβ(1-42)-Fibrillen-Polymorphs. Zur Aufklärung der Struktur musste zuerst eine vollständige de-novo Resonanzzuordnung mit ein- und höher-dimensionalen Spektren erfolgen. Die Analyse der gemessenen chemischen Verschiebungen lieferte uns ein Sekundär- Strukturmodell, sowohl als auch Hinweise auf den Protonierungsgrad saurer Aminosäuren und der sterischen Seitenkettenorientierung. Die Detektion von langreichweitigen Kontakten konnte zusätzlich die Cryo-EM Ergebnisse bestätigen. Zusammengenommen ergaben alle Resultate eine S-förmige Mittendomäne und C-Terminus der Fibrille, mit einem weniger rigiden N-Terminus. Beachtenswert ist, dass vorherige Festkörper-NMR- oder Cryo-EM-Studien unterschiedliche Aβ(1- 42)-Fibrillen-Polymorphe beschrieben haben. Zur Untersuchung der Temperaturabhängigkeit von Probenvorbereitung, Auflösung und Signalverstärkung benutzten wir ”Dynamic Nuclear Polarization” (DNP)- Messungen. Wir testeten zwei verschiedene Probenvorbereitungs-Protokolle mit dem Ergebnis, dass das Standardprotokoll unserem angepassten Protokoll überlegen ist. Zusätzlich wiesen wir nach, dass kryogene Temperaturen zwar die spektrale Auflösung verschlechtern, dieser Effekt aber mit der Messung in einem höheren statischen Magnetfeld teilweise kompensiert werden kann. Das Messen von Relaxationszeiten in der Transversalebene (T1ρ) mit unserem experimentellen Aufbau, war nicht dazu geeignet einen mobileren N-Terminus zu detektieren, verglichen mit der rigiden Mittendomäne und dem C-Terminus. Desweiteren untersuchten wir die Fibrillen-Wassergrenzfläche durch Messung des Polarisationstransfers von Wasser auf die Fibrille, der durch austauschbare Protonen erleichtert wurde. Abschließend versuchten wir den Effekt von Thioflavin-T-Bindung an die Fibrille zu untersuchen, was jedoch durch den niedrigen pH-Wert unserer Probe verhindert wurde. Zuletzt wurde eine Fibrillenprobe bei pH 7 untersucht, wobei die Ergebnisse auf ein mögliches zweites Konformer hinweisen. The 42 amino acid residue amyloid-β (Aβ(1-42)) peptide is involved in the development of Alzheimer’s disease. Since it is more prone to aggregation than the more abundant Aβ(1-40) and furthermore involved in the early onset of the disease, it is of particular research interest. In the literature it has been shown, that these two addtional C-terminal residues not only accelerate the aggregation kinetics, but also lead to the formation of different molecule interfaces, β-sheet lengths and β-sheet arrangements. In this combined study, we determined the structure of an hitherto undescribed recombinantly expressed Aβ(1-42) fibril polymorph with cryo-EM and solid-state NMR (ssNMR) on the same sample. To achieve this goal, a complete de-novo resonance assignment had to be accomplished by the acquisition of one and higher dimensional spectra. The analysis of the measured chemical shifts yielded the secondary structure model, as well as hints for the protonation state of the acidic amino acids and the steric side-chain orientation. Furthermore, we could observe long-range contacts, confirming the structure determined by cryo-EM. All results combined exhibited a rigid S-shaped middle domain and C-terminus of the fibril, with a less rigid Nterminus. Notably, published cryo-EM or ssNMR studies of Aβ(1-42) fibril structures up to date described other polymorphs. To investigate low temperature effects on sample preparation, resolution and signal enhancement, we carried out dynamic nuclear polarization (DNP) measurements. We tested two different sample preparation protocols, finding the standard preparation seems to be superior to our customized procedure. In addition, we found that cryogenic temperatures decreased the spectral resolution, which could be partly restored by measuring in higher static magnetic fields. Measuring relaxation rates in the transverse plane (T 1 ρ ) with our experimental setup, was not suitable to detect a rather flexible N-terminus compared to the middle domain and the C-terminus. Additionally, we probed the fibril water interface by measuring the polarization transfer from water to the protein, facilitated by exchangeable protons. Afterwards, we tried to study the effect of Thioflavin-T (ThT) binding to the fibril, however the binding was impeded by the low pH of our sample. Lastly, fibrils prepared at pH 7 were compared to the initial fibril sample at pH 2, indicating a possible second conformer at the N-terminus.
Quelle:	153
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Bezug:	2014-2018
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » NMR - Spektroskopie biologischer Makromoleküle
Dokument erstellt am:	09.06.2020
Dateien geändert am:	09.06.2020
Promotionsantrag am:	26.11.2018
Datum der Promotion:	13.12.2018