Dokument: Anreicherung und Identifizierung von Austauschfaktoren kleiner GTPasen und strukturbiologische Untersuchungen eines Nukleotid-modifizierten Rab-Proteins
| Titel: | Anreicherung und Identifizierung von Austauschfaktoren kleiner GTPasen und strukturbiologische Untersuchungen eines Nukleotid-modifizierten Rab-Proteins | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=49526 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20190628-103527-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Koch, Daniel [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Ahmadian, Reza [Gutachter] Prof. Dr. Brenneisen, Peter [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Rab-Proteine gehören zur Ras-Superfamilie kleiner G-Proteine und erfüllen wichtige Funktionen
in der Regulation des intrazellulären Vesikeltransportes. Zentrales mechanistisches Merkmal von G-Proteinen ist die Fähigkeit das Nukleotid GTP zu binden und zu GDP zu hydrolysieren. In Abhängigkeit des jeweiligen Nukleotidstatus weisen kleine G-Proteine eine unterschiedliche Konformation auf, welche die jeweiligen Funktionen vermittelt: GTP-gebunden können sie mit sogenannten Effektorproteinen interagieren und somit eine spezifische Funktion ausüben. Im GDP-gebundenen Zustand hingegen sind sie inaktiv. Aufgrund ihrer Fähigkeit einen aktiven oder inaktiven Zustand einzunehmen, werden kleine G-Proteine oft auch als „molekulare Schalter“ bezeichnet. Um die funktionellen Zustände räumlich und zeitlich genau zu kontrollieren sind weitere Proteine nötig: GEFs (engl. Abkürzung von guanine nucleotide exchange factors) und GAPs (engl. Abkürzung von GTPase activating proteins). Während GEFs den Austausch von GDP zu GTP und damit eine Aktivierung des G-Proteins begünstigen, stimulieren GAPs die Hydrolyse des GTPs zu GDP und damit die Inaktivierung. Um zu verstehen wie genau ein Rab-Protein seine Funktion ausübt, ist es daher notwendig, auch den Kontext seiner Regulation zu kennen. Obwohl über 60 humane Rab-Proteine bekannt sind, weiß man vergleichsweise wenig über ihre Regulation durch GEFs, da bislang nur wenige Rab-GEFs identifiziert wurden. Die Heterogenität ihrer Sequenz und Struktur erschwert zudem eine in silico Identifikation weiterer Rab-GEFs über die Suche nach verwandten Genen im Genom. Um die Identifikation neuer GEFs zu erleichtern wurde in dieser Arbeit ein Protokoll für die Identifikation von GEFs kleiner G-Proteine via sogenannter Pulldown-Experimente angepasst und weiterentwickelt. Hierbei wurde der enzymatischen Mechanismus von GEFs ausgenutzt, bei dem der intermediäre nukleotidfreie Zustand des G-Proteins stabilisiert wird. In diesem besitzen GEFs eine sehr hohe Affinität zum nukleotidfreien G-Protein, was die Anreicherung begünstigt. Der Nachweis der Anwendbarkeit des Protokolls mit dem bekannten Rab/GEF-Paar Sec4/Sec2 ist im Rahmen dieser Arbeit gelungen. Um experimentelle Beobachtungen an G-Proteinen auf einen bestimmten Aktivitätszustand zurückführen zu können, ist in vitro das Verwenden nicht-hydrolysierbarer Nukleotidanaloga wie GppNHp möglich. In vivo können solche Analoga jedoch durch intrazelluläre Nukleotide ausgetauscht werden. Alternative Strategien zur Erstellung konstitutiv aktiver oder inaktiver G-Proteine sind oft ineffektiv oder artefaktbehaftet. Um sichere Kontrolle über den Nukleotidstatus zu erlangen, wurden in der Arbeitsgruppe von Prof. Roger Goody neuartige Nukleotidanaloga entwickelt, welche kovalent an G-Proteine gebunden werden können. Dies verhindert einen Austausch und stellt sicher, dass das Protein in einem definierten Nukleotidstatus arretiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mittels Röntgenkristallstrukturanalyse für das Rab-Protein Ypt7 gezeigt, dass entsprechende GTP-Analoga keinen störenden Effekt die Struktur von Ypt7 ausüben.Rab proteins belong to the ras superfamily of small GTPases and play important roles in the regulation of vesicular transport within the eukaryotic cell. The central mechanistic hallmark of all GTPases is their ability to bind the nucleotide GTP and to hydrolyze it to GDP. Dependent on the nucleotide state small GTPases can take specific conformations which serve different roles: GTP-bound small GTPases can interact with so called effector proteins and thereby actively mediate a specific function, whereas in their GDP-bound state, they are inactive. Due to their ability to cycle between an active and inactive state, small GTPases are often called „molecular switches“. In order to control their activity in a spatially and temporally exact manner, additional proteins are necessary: guanine nucleotide exchange factors (short: GEFs) and GTPase activating proteins (short: GAPs). While GEFs facilitate the exchange of GDP for GTP and thereby activate the associated GTPase, GAPs stimulate the hydrolysis of GTP to GDP and thereby inactivate the GTPase. As for any GTPase the knowledge of the regulatory context of a Rab protein is thus crucial to fully understand how it exerts its function. However, although over 60 human Rab proteins have been identified so far, comparatively little is known about the regulation of Rab proteins by their GEFs, since only few Rab-GEFs have been identified. The main reason for this is that the identification of Rab-GEFs by in silico approaches which search for cognate genes has been hampered by the huge diversity of structures and sequences of Rab-GEFs. In order to facilitate the identification of new GEFs for Rab proteins this dissertation presents a protocol that has been adapted and optimized to perform specific pull-down experiments for GEFs. It exploits the enzymatic mechanism of GEFs by stabilizing an intermediate, nucleotide-free state of GTPases in which they have a very high affinity towards their GEF, favoring their enrichment in the pull-down experiments. Evidence of the protocol’s applicability is given within this dissertation using the known Rab/GEFcouple Sec4/Sec2 as an example. To correlate experimental observations of G-proteins with a defined nucleotide state in vitro, one can use non-hydrolyzable nucleotide analogs such as GppNHp. In vivo, however, these analogs are prone to be exchanged with intracellular nucleotides. Alternative strategies for creating constitutive active or inactive G-proteins are often of dubious efficiency or charged with artifacts. In order to gain definitive control over a G-protein’s nucleotide state, the research group of Prof. Roger Goody has developed a new kind of nucleotide analogs which can be covalently linked to the G-protein. The covalent bond prevents nucleotide exchange and ensures a defined nucleotide state. Based on x-ray crystallographic analyses it is shown within this thesis that the modification of the small GTPase Ypt7 with the GTP variant of this new kind of nucleotides does not disturb the structure of Ypt7. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie II | |||||||
| Dokument erstellt am: | 28.06.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 28.06.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 01.01.2018 | |||||||
| Datum der Promotion: | 21.02.2019 |
