Dokument: Key regulators in inflammation and apoptosis

Titel:	Key regulators in inflammation and apoptosis
Weiterer Titel:	Molekulare Analyse apoptotischer und inflammatorischer Prozesse
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=4952
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20070625-093748-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dipl. Biol. Pohlmann, Stephan [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,58 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 22.06.2007 / geändert 22.06.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Schulze-Osthoff, Klaus [Gutachter] Prof. Dr. Mehlhorn, Hans-Peter Heinz [Gutachter]
Stichwörter:	Apoptose, NFkappaB, Tyrosinkinase, p53, IkappaBzeta
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die vorliegende Arbeit befasste sich mit verschiedenen Aspekten der Signaltransduktion von apoptotischen und inflammatorischen Prozessen. Im Mittelpunkt stand die funktionelle Charakterisierung des Tumorsuppressors p53 in Mitochondrien, die Bedeutung des neuen IκB-Homologs IκBζ für die Zytokin-Induktion sowie die Rolle der Tyrosinkinase Lck in der Apoptose von T-Zellen. Mitochondriale Translokation von p53 in Abwesenheit von Apoptose Der Tumorsuppressor p53 spielt eine wichtige Rolle bei der Regulation von Zellzyklus-, Seneszenz- und Apoptose-Prozessen. In aktuellen Studien wurde eine Translokation von p53 an Mitochondrien mit einer transkriptionsunabhängigen Funktion von p53 in der Apoptose assoziiert. In der vorliegenden Arbeit wurde die mitochondriale Translokation von p53 näher charakterisiert, um zu untersuchen, ob ein Defekt dieses Prozesses an der Apoptose-Resistenz von Tumorzellen beteiligt ist. Nach ionisierender Bestrahlung konnte in verschiedenen Tumorzellen eine Translokation von p53 an die Mitochondrien nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass MCF-7-Brustkarzinomzellen sowie weitere Zelllinien eine funktionelle p53-Antwort nach Bestrahlung aufweisen und die Expression der p53-Targetgene p21, Bax und Puma induzieren. Trotz einer funktionellen p53-Antwort und der mitochondrialen Translokation von p53 verursachte eine Bestrahlung der Zellen jedoch keine Apoptose, sondern zelluläre Seneszenz. Während die nukleäre Expression von nativem p53 Apoptose induzierte, konnte selbst die gezielte Expression von p53 an den Mitochondrien keinen Zelltod auslösen. Diese Daten zeigen somit, dass eine Translokation von p53 an die Mitochondrien nicht zwangsläufig Apoptose induziert und daher eine Apoptose-Resistenz vermutlich auf einem Defekt unterhalb der mitochondrialen p53-Antwort beruht. IκBζ als Mediator der NF-κB-abhängigen Zytokin-Induktion Mitglieder der IκB-Familie fungieren in der Regel als Inhibitoren des proinflammatorischen Transkriptionsfaktors NF-κB. Das kürzlich identifizierte Protein IκBζ weist jedoch ungewöhnliche Eigenschaften auf. Anders als klassische IκB-Proteine ist IκBζ nicht konstitutiv im Zytosol, sondern im Zellkern lokalisiert, wo es induzierbar exprimiert wird. Ähnlich wie andere IκB-Proteine besitzt IκBζ Ankyrinwiederholungen an seinem C-Terminus, die mit den NF-κB-Untereinheiten p50 oder p65 interagieren. Aufgrund einer essentiellen Rolle von NF-κB in der Immunantwort wurde in dieser Arbeit der Einfluss von IκBζ auf die Synthese von Zytokinen untersucht. Überraschenderweise führte die Expression von IκBζ nicht zu einer Hemmung von NF-κB-Targetgenen, sondern resultierte in einer direkten transkriptionellen Aktivierung verschiedener Zytokine. Nach Transfektion oder retroviraler Expression von IκBζ wurde auf mRNA- und Proteinebene eine starke Induktion von IL-8, GM-CSF, MCP-1 und IL-6 beobachtet. Struktur-Funktionsanalysen zeigten, dass für die Zytokin-Induktion sowohl der C-Terminus mit den Ankyrindomänen als auch der N-Terminus, der eine Transaktivierungsdomäne besitzt, erforderlich ist. Durch Versuche in NF-κB p65- und p50-defizienten Zellen wurde festgestellt, dass die Zytokin-Induktion durch IκBζ ebenso die DNA-bindenden Untereinheiten des Transkriptionsfaktors benötigt. In einer Array-Analyse von Endothelzellen konnten neben Zytokinen weitere Targetgene identifiziert werden, die eine Rolle von IκBζ in der Apoptose und Mitose nahe legen. In der Tat induzierte die Überexpression von IκBζ die Aktivierung von Caspasen und Apoptose. Die Befunde zeigen daher, dass IκBζ primär nicht als Repressor, sondern als Aktivator von NF-κB-Targetgenen fungiert und somit einen weiteren Kontrollpunkt der NF-κB-Aktivierung darstellt. Die Tyrosinkinase Lck und ihre Rolle in der Apoptose Die Tyrosinkinase Lck spielt eine essentielle Rolle bei der T-Zellaktivierung. Jüngere Arbeiten deuteten daraufhin, dass Lck auch eine proapoptotische Funktion bei Zelltodprozessen in T-Zellen besitzt, jedoch wurden bislang alle Untersuchungen in dem Lck-defizienten Jurkat-Zellklon J.CaM durchgeführt. Um den Mechanismus der Apoptose-Regulation durch Lck zu charakterisieren, wurden zunächst unterschiedliche Lck-defziente Jurkat-Zellklone untersucht, die unterschiedlicher Herkunft waren oder durch eine unabhängige Mutagenese isoliert wurden. Es stellte sich heraus, dass im Einklang mit der Literatur JCaM-Zellen eine Apoptose-Resistenz gegenüber einer Vielzahl von Apoptose-Stimuli besaßen. Überraschenderweise wurde jedoch trotz einer Defizienz der Lck-Kinase keine Apoptose-Resistenz in den anderen Jurkat-Zellen nachgewiesen. Vielmehr wurde in diesen Zellen nach Behandlung mit Chemotherapeutika eine deutliche Apoptose sowohl durch Analyse des Zelltodes wie auch durch Nachweis der Caspase-Aktivierung gemessen. Westernblot-Analysen erwiesen, dass Apoptose-resisitente JCaM-Zellen neben Lck ebenso einen Verlust des proapoptotischen Bcl-2-Proteins Bak besaßen. Bei dieser Bak-Defizienz handelte es sich jedoch eindeutig um einen Lck-unabhängigen Effekt, da andere Lck-defiziente Zellen eine normale Bak-Expression aufwiesen. Somit konnte zwar die beschriebene Apoptose-Resistenz von Lck-defizienten JCaM-Zellen bestätigt und auf eine fehlende Expression von Bak zurückgeführt werden. Es ließ sich jedoch eindeutig schlussfolgern, dass die Lck-Defizienz keine primäre Ursache für eine Apoptose-Resistenz darstellt. Mitochondrial localization of p53 in the absence of apoptosis The tumor suppressor p53 is known to trigger apoptosis in response to various death stimuli by transactivation of target genes. Additionally, a transcription-independent mechanism was postulated recently to contribute to p53-induced apoptosis. With regard to this, it was for instance demonstrated that stress-activated p53 translocates to the mitochondria only under conditions that lead to apoptosis, but not when cell cycle arrest is induced. At the mitochondria, p53 was shown to directly interact with the anti-apoptotic Bcl-2 and Bcl-xL proteins leading to activation of the pro-apoptotic Bax protein and subsequent activation of the mitochondrial death pathway. As MCF-7 breast carcinoma cells that harbour a fully active transcriptional p53 protein are sensitive to apoptosis induction by chemotherapeutic drugs, but remarkably resistant to gamma-irradiation (IR)-induced apoptosis, it was feasible to speculate that the radio-resistant phenotype of these cells might be caused by an improper or non-functional translocation of p53 to the mitochondria. In order to elucidate such a scenario, the subcellular localisation of p53 in MCF-7 cells that were either exposed to IR or to different chemotherapeutic drugs was compared. Intriguingly, similar amounts of p53 were found to be associated with mitochondria in cells treated with apoptosis-inducing chemotherapeutic drugs and in cells that were arrested in the G2/M phase of the cell cycle following exposure to IR. Similar results were obtained using other cell systems that were either resistant or sensitive to these stimuli. Furthermore, in contrast to expression of nuclear p53, targeted expression of p53 at the mitochondria was not able to induce apoptosis. Together, these data demonstrate that a stress-induced translocation of p53 to mitochondria is not necessarily associated with apoptosis induction and that other, yet undefined, mechanisms must contribute to the radio-resistant phenotype of these cells. IκBζ and its function as a key regulator in inflammation and apoptosis In the second part of this PhD thesis, a possible role of the novel IκB protein IκBζ in the induction of cytokines that are crucial mediators of inflammatory processes was investigated. IκBζ was first identified in our laboratory by a subtractive hybridization approach using two HeLa cell lines with different apoptosis susceptibilities. Similiar to all IκB proteins, IκBζ contains six C-terminal ankyrin repeats that mediate binding to the p65 and p50 subunits of the transcription factor NF-κB, thereby inhibiting its transcriptional activity. In contrast to other IκB proteins, however, IκBζ is localized in the nucleus where it associates with matrix-associated deacetylase nuclear bodies. Interestingly, and in contrast to other IκB proteins that merely act as transcriptional repressors of NF-κB, it was found that IκBζ augmented expression of various cytokines such as IL-6, IL-8, GM-CSF and MCP-1. This effect could be attributed to the N-terminal domain of IκBζ that was shown in parallel studies to contain a transactivation domain. However, studies using p50- or p65-deficient mouse embryonic fibroblasts demonstrated that the increased cytokine production was not mediated by IκBζ alone, but critically depends on its interaction with a functional NF-κB. These findings were also verified in endothelial cells using micro-array analyses that in addition revealed activation and repression of multiple apoptosis- and mitosis- relevant genes. Indeed it could be demonstrated that IκBζ activates caspases and finally induces apoptosis. In summary, unlike classical NF-κB inhibitors such as IκBα, IκBζ plays a central role in the induction and repression of a selective pool of genes critical for diverse processes by differentially controlling NF-κB activity with either its N- or C-terminus. The role of the tyrosine kinase Lck in apoptosis Over the past 15 years, the function of the tyrosine kinase Lck in vital cellular processes such as T-cell growth and differentiation has been intensively investigated. Recent studies indicated that Lck is also involved in apoptosis induction of T-lymphocytes which was attributed to its stimulatory effect on the expression of the pro-apoptotic Bcl-2 protein Bak. However, this conclusion was solely reached by using a single Lck-deficient cell line (JCaM) that did not express Bak and, in addition, no experiments were provided in which re-introduction of the Lck gene resulted in Bak expression. To re-evaluate the role of Lck in the regulation of Bak expression and instigation of the mitochondrial death pathway, three individual Lck-deficient JCaM cell clones (JCaM, JCaM/Abr, JCaM/ATCC) obtained from different sources were investigated. Surprisingly, only the JCaM cells were resistant to apoptosis induced by either anticancer drugs or tumor necrosis factor (TNF) that engage the mitochondrial and the death receptor pathway, respectively. JCaM/Abr and JCaM/ATCC cells, in contrast, were as sensitive as wild-type Jurkat cells. This was confirmed by immunoblot analyses as well as by substrate cleavage assays showing that caspase-3 activation was only induced by these treatments in the latter two cell lines, but not in JCaM cells. Consistent with these findings, Bak expression was found in apoptosis-sensitive Lck-deficient cells, but was undetectable in the JCaM cell line. Together, these data clearly demonstrate the absence of any correlation between Lck and Bak expression, and therefore suggest that the apoptosis resistance of JCaM cells is solely dependent on the loss of Bak that must have occurred independently of the loss of Lck.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	22.06.2007
Dateien geändert am:	22.06.2007
Promotionsantrag am:	15.05.2007
Datum der Promotion:	18.06.2007