Dokument: Molecular adaptations and post-translational regulation of C4-NADP-malic enzyme

Titel:	Molecular adaptations and post-translational regulation of C4-NADP-malic enzyme
Weiterer Titel:	Molekulare Adaptationen und posttranslationale Regulation von C4-NADP-abhängigem Malatenzym
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=49466
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200518-111024-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M.Sc. Bovdilova, Anastasiia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,61 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.04.2019 / geändert 30.04.2019
Beitragende:	Maurino, Veronica Graciela [Gutachter] Prof. Dr. Westhoff, Peter [Gutachter]
Stichwörter:	C4 photosynthesis, NADP-malic enzyme, maize
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die C4-Photosynthese stellt ein Mechanismus zur Kohlenstoff Anreicherung dar, welcher selektiv Kohlenstoffdioxid in der Umgebung von RubisCO anreichert und gleichzeitig den Verlust von fixiertem Kohlenstoff während der Photorespiration verringert. In den Pflanzenarten, welche den auf zwei Zellarten basierenden C4 Stoffwechselweg nutzen, wird diese zielgerichtete Kohlenstoffdioxid Akkumulation mittels der räumlichen Aufteilung der photosynthetischen Prozesse zwischen den Mesophyll und Bündelscheidenzellen erreicht. Abhängig von der Art und der zellulären Lokalisierung der dominierenden Decarboxylase in den Bündelscheidenzellen, können die C4 Pflanzen in drei unterschiedliche Untergruppen unterteilt werden – die NADP ME, NAD ME und die PEP CK Varianten. Die photosynthetische NADP ME Isoform (C4 NADP ME) hat sich aus ihrer eng verwandten nicht photosynthetischen Isoform (nonC4 NADP ME) im Lauf der Evolution entwickelt. Die C4 NADP ME Isoform hat sich einige einzigartige biochemische und strukturelle Eigenschaften angeeignet, die, zusammen mit den Unterschieden in den Expressionsleveln und –mustern, entscheidend für das Erfüllen der neuen biologischen Funktion sind. In dieser Doktorarbeit wurden die wichtigsten molekularen Veränderungen aufgeklärt, welche zu den C4 bezogenen biochemischen und strukturellen Eigenschaften der C4 NADP ME von Mais im Laufe der Evolution geführt haben. Mit Hilfe eines Algorithmus konnten die unterschiedlich konservierten Aminosäurenreste in den C4- und nonC4-Isoformen von eng verwandten C4 NADP ME Gräsern identifiziert werden. Außerdem wurde die Kristallstruktur von C4 NADP ME aus Mais in ihrer Apoform ermittelt. Basierend auf diesen Studien, wurden vier Aminosäurenreste für die weiterführenden biochemischen und strukturellen Untersuchungen ausgewählt. Die Ergebnisse dieser Experimente, welche mit der wildtypischen und den mutagenisierten Enzymvarianten durchgeführt wurden, zusammen mit den Ergebnissen der Kristallisierungsstudie bestätigten die Beteiligung dieser vier Aminosäurenreste an der Ausprägung der wesentlichen C4 Eigenschaften: Phe140 ist essentiell für die homotetramerische Anordnung von C4 NADP ME; und die Gln503, Leu544 und Glu339 sind verantwortlich für die hohe Affinität zum Substrat Malat. Parallel dazu wurde eine Phosphorylierungsstelle an einem Serinrest in dem Mais C4 NADP ME mittels massenspektrometrischen Analysen identifiziert. Weiterführende Versuche zeigten, dass diese Serinphosphorylierung von C4 NADP ME in den ersten Stunden der Belichtung zunahm; dabei wurde die höchste Phosphorylierung nach zwei Stunden Lichtexposition beobachtet. In vitro Studien mit der heterologen Wildtyp und der mutagenisierten Enzymform mit dem nachgeahmten Phosphorylierungszustand zeigten eine verringerte kinetische Leistung des mutagenisierten Enzyms und implizieren, dass die Phosphorylierung ein Mechanismus zur Verringerung der Aktivität dieser Decarboxylase in vivo darstellt. Die Analyse der Kristallstruktur der Sorghum C4-NADP-ME mit dem gebundenen NADP+ weist auf die Beteiligung dieses Serinrestes bei der NADP+ Bindung im aktiven Zentrum hin. Das liefert einen Hinweis auf den molekularen Mechanismus für den hemmenden Einfluss der Phosphorylierung. C4 photosynthesis is a carbon concentrating mechanism, which selectively enriches carbon dioxide around RubisCO and simultaneously reduces wasteful photorespiration. In plant species exhibiting the two-celled C4 pathway, this selective CO2 accumulation is achieved due to the spatial separation of the photosynthetic processes between mesophyll and bundle sheath cells. Depending on the type and subcellular localization of the predominant decarboxylase in the bundle sheath cells, plants performing C4 photosynthesis can be divided into three different subtypes – NADP ME, NAD ME and PEP CK variants. The photosynthetic NADP ME isoform (C4 NADP ME) has evolved from its closely related plastidic non photosynthetic isoform (nonC4 NADP ME). In the course of evolution, C4 NADP ME has acquired several unique biochemical and structural properties, which are, together with the differences in the expression levels and patterns, crucial for fulfilling its new biological function. In this thesis, main molecular events leading to the C4 related biochemical and structural characteristics of the C4 NADP ME from maize were elucidated. An algorithm has been developed to identify amino acid residues differentially conserved in C4 and nonC4 isoforms of closely related C4-NADP-ME grasses. Moreover, the crystal structure of the maize C4 NADP ME in its apoform was obtained. Based on these studies, four candidate amino acids were selected for deeper biochemical and structural analyses. Results of these experiments performed with the wild-type enzyme and mutagenized forms, together with the results of the crystallization study confirmed the involvement of the candidate amino acid residues in conferring fundamental C4 properties: Phe140 is critical for the homotetrameric assembly of the C4 NADP ME; and Gln503, Leu544 and Glu339 are responsible for the high affinity to the substrate malate. In parallel, mass spectrometry analyses identified a unique serine phosphorylation site within the C4 NADP ME in protein extracts of maize leaves. Further analysis revealed that phosphorylation of this serine increases during the first hours of illumination, with the highest levels observed at two hours into light. In vitro studies with the phosphomimetic C4 NADP ME showed reduced activity of the enzyme compared to the wild type, implying that phosphorylation is a mechanism to reduce the decarboxylase activity in vivo. Analysis of the crystal structure of sorghum C4-NADP-ME with bound NADP+ indicated that the serine residue is involved in NADP+ binding at the active site. This allowed to propose a molecular mechanism for the inhibitory influence of the phosphorylation event.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	18.05.2020
Dateien geändert am:	18.05.2020
Promotionsantrag am:	29.01.2019
Datum der Promotion:	27.03.2019