Dokument: Bioactive Secondary Metabolites from Endophytic and Marine Fungi

Titel:	Bioactive Secondary Metabolites from Endophytic and Marine Fungi
Weiterer Titel:	Bioaktive Sekundärmetaboliten aus Endophytischen und Marinen Pilzen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=49234
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200518-104743-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Frank, Marian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 36,61 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 04.04.2019 / geändert 04.04.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Proksch, Peter [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Kassack, Matthias U. [Gutachter]
Stichwörter:	fungal secondary metabolites; marine fungi; endophytes; OSMAC; co-cultivation; cytotoxicity
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The emergence of therapy-resistant cancer and infectious diseases fuels the demand for novel therapeutic agents. Bioactive compounds from nature have always met that demand or inspired optimized synthetic analogs in the past. Marine derived fungi and other microorganisms are still relatively underexplored concerning their secondary metabolites, when compared to terrestrial microorganisms. The inherit potential of marine derived fungi can further be expanded by unlocking silent biogenetic gene clusters using OSMAC (One Strain Many Compounds) and co-cultivation experiments or by producing semisynthetic analogs. This makes them an invaluable resource for bioprospecting and a worthy target for investigation. This doctoral thesis includes three major projects desribed in manuscript form. The first project deals with the stability, mode of action and structure-activity-relation (SAR) of the mycotoxin phomoxanthone A (PXA), which was isolated from Phomopsis longicolla, an endophyte of the Chinese mangroveplant Sonneratia caseolaris. The second and third project deal with the investigation of the fungal strains Penicillium canescens and Aspergillus ochraceus respectively, which were both derived from the inner tissue of the Mediterranean sponges Agelas oroides. For those projects, the main work revolved around fermentation with modification of culture parameters (OSMAC, co-culture and feeding experiments) to increase the discovery rate of novel fungal metabolites. The structures of all isolated secondary metabolites were unequivocally elucidated by 1D and 2D NMR (nuclear magnetic resonance) experiments and high resolution electronspray ionisation mass spectrometry (HRESIMS), whereas their stereochemical configurations were elucidated by optical rotation measurements, Marfeys’s method or electronic circular dichroism (ECD) calculations. First Project: Investigation of the mycotoxin phomoxanthone A: The results of the first project are published and included in chapters 2 (Phomoxanthone A - From Mangrove Forests to Anticancer Therapy) and to a minor degree in chapter 3 (The Mycotoxin Phomoxanthone A Disturbs the Form and Function of the Inner Mitochondrial Membrane). The work of Rönsberg et al. (Rönsberg et al. 2013) was continued to investigate the mode of action of PXA. PXA was produced at multigram scale through solid rice fermentation and ethyl acetate extraction of P. longicolla to meet the demand for indepth target finding studies during our cooperation with the working group of Sebastian Wesselborg (Böhler et al. 2018). The stability of PXA in several solvent systems was investigated to explain the activity decline in frozen stock solutions and a rearrangement of PXA to dicerandrol C was discovered (discussed in chapter 6.5). A protocol for proper handling of PXA was established and made further mechanistic studies possible. The SAR were investigated by preparation of six semisynthetic derivatives that were tested for their cytotoxic activity against Ramos B- and Jurkat T-lymphocytes. All synthesized compounds were considerably less active than PXA, but the magnitude of activity loss allowed for general SAR predictions. Further SAR were established by extensive bioactivity-data literature comparison of PXA and structurally related compounds. Second Project: Investigation of the sponge derived fungus Penicillium canescens The results of the second project are ready to be submitted for publication and are included in chapter 4 (Brominated Azaphilones from the Sponge-Associated Fungus Penicillium canescens). The fungus P. canescens was isolated from the inner tissue of the Mediterranean sponge Agelas oroides. Initial solid rice fermentation showed promising cytotoxic and antitubercular activity of the ethyl acetate (EtOAc) crude extract. Chromatographic investigation of the extract yielded one new chlorinated diphenylether (penicanether) and thirteen known compounds. The majority of isolated compounds were intermediates or byproducts of griseofulvin biosynthesis. Adding 5% sodium bromide (NaBr) to rice medium changed the secondary metabolite pattern and strongly increased the amount of unchlorinated benzophenone intermediates and xanthones, including the previously absent 1,3,5,6 tetrahydroxy-8-methylxanthone. While the amount of griseofulvin sharply decreased and no bromo analogs were detected, two novel brominated azaphilones, bromophilones A and B, were isolated. All new compounds were unequivocally elucidated by 1D and 2D NMR experiments and HRESIMS data. The relative configuration of bromophilones A and B was assigned by nuclear Overhauser effect (NOE) experiments and detailed 13C-chemical shift analysis and literature comparison and they were identified as epimers. Bromophilone B exhibited cytotoxicity against the mouse lymphoma cell line L5178Y (IC50 8.9 µM), as well as against the human ovarian cancer cell line A2780 (IC50 2.7 µM), whereas the epimer bromophilone A was considerably less active.   Third Project: Investigation of the sponge derived fungus Aspergillus ochraceus The results of the third project were submitted to Marine Drugs in 12/2018 and are included in chapter 5 (Cryptic Secondary Metabolites from the Sponge-Associated Fungus Aspergillus ochraceus). The fungus A. ochraceus was isolated from the inner tissue of the Mediterranean sponge Agelas oroides. The initial solid rice fermentation EtOAc extract showed promising cytotoxic and antitubercular activity and an interesting chromatographic profile. The investigation of the large-scale extract yielded sixteen known compounds, which were mainly comprised of ochratoxin A (OTA), penicillic acid (PA) derivatives, tryptophan-derived alkaloids (circumdatins) and polyketide pigments (e.g. viomellein). The accumulation of these metabolites was influenced by addition of several inorganic halide and nitrogen salts. Fermentation on solid beans medium yielded the new diketopiperazine alkaloid waspergillamide B, which features a highly unusual p-nitrobenzoic acid subunit. Co-cultivation with Bacillus subtilis yielded two new PA-derivatives, ochraspergillic acids A and B, which seem to be of mixed fungal-bacterial biosynthesis. Ochraspergillic acid A was also produced in axenic fungal culture following feeding of tryptophan or anthranilic acid. The structures of new compounds were elucidated based on 1D and 2D NMR experiments as well as from their HRESIMS data. The absolute configuration of waspergillamide B was established by hydrolysis and conversion of the amino acids using Marfey’s reagent. The compounds viomellein and ochratoxin B exhibited strong cytotoxicity against the human ovarian carcinoma cell line A2780 with IC50 values of 5.0 and 3.0 μM, respectively. Das Aufkommen therapieresistenter Krebs- und Infektionskrankheiten heizt den Bedarf an neuartigen Arzneistoffen an. Bioaktive Naturstoffe haben in der Vergangenheit diesen Bedarf stets gedeckt oder zur Entwicklung verbesserter, halbsynthetischer Analoga geführt. Marine Pilze und andere Mikroorganismen stellen eine, bezüglich ihrer Sekundärmetaboliten, immernoch relativ unerforschte Gruppe dar, im Vergleich zu an Land lebenden Mikroorganismen. Das den marinen Pilzen innewohnende Potential kann noch erweitert werden, indem schlafende Biosynthese-Gencluster durch den Einsatz von OSMAC- oder Co-Kultivierungsexperimenten induziert werden. Dies macht sie zu einer unverzichtbaren Quelle auf der Suche nach bioaktiven Naturstoffen. Diese Dissertation gliedert sich in drei Hauptprojekte, die in Manuskriptform präsentiert werden. Das erste Projekt befasst sich mit Stabilitäts-, Wirkmechanismus- und Struktur-Wirkungs-Beziehungs-Untersuchungen (SWB) zu dem Mykotoxin Phomoxanthon A (PXA), das aus Phomopsis longicolla, einem Endophyten der chinesischen Mangrovenpflanze Sonneratia caseolaris, isoliert wurde. Das zweite und dritte Projekt befassen sich jeweils mit einem der beiden Pilze Penicillium canescens und Aspergillus ochraceus, welche aus dem inneren Gewebe des Mittelmeerschwammes Agelas oroides isoliert wurden. Der Schwerpunkt in diesen Projekten liegt darauf Variationen der Fermentationbedingungen zu finden (OSMAC, Co-Kultivierung, Fütterungsversuche). Das Ziel hierbei ist es, die Akkumulation neuer Sekundärmetabolite zu induzieren. Die Strukturen aller isolierten Sekundärmetaboliten wurden durch den Einsatz von ein- und zweidimensionaler Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) und Massenspektrometrie (MS) aufgeklärt. Die absolute Konfiguration einiger Substanzen wurde mithilfe von Messungen der optischen Aktivität, Marfey Analyse und elektronischer Circular Dichroismus Berechnungen (ECD) bestimmt. Erstes Projekt: Untersuchungen zum Mykotoxin Phomoxanthon A Die Ergebnisse zum ersten Projekt wurden bereits veröffentlicht und umfassen Kapitel 2 (Phomoxanthon A - Aus dem Mangrovenwald zur Krebstherapie) und in einem geringeren Umfang Kapitel 3 (Das Mykotoxin Phomoxanthon A stört die Form und Funktion der inneren Mitochandrienmembran). Die Arbeit von Rönsberg et al. (Rönsberg et al. 2013) wurde fortgeführt um den Wirkmechanismus von PXA zu untersuchen. Um die Mengenanforderungen an PXA für vertiefende Targetfindungsstudien der kooperierenden Arbeitsgruppe von Sebastian Wesselborg zu decken (Böhler et al. 2018), wurde die Substanz durch Ethylacetat (EtOAc) Extraktion der Reismedium-Fermentation des Pilzes Phomopsis longicolla im Multigramm-Maßstab produziert. Da die gefrorenen PXA-Stammlösungen über die Zeit einen Aktivitätsverlust zeigten, wurde die Stabilität von PXA in verschiedenen Lösungsmitteln untersucht und eine Umlagerungsreaktion zu Dicerandrol C beobachtet (beschrieben in Kapitel 6.5). Es wurde ein Protokoll zur korrekten PXA-Handhabung entwickelt, welches weitere mechanistische Untersuchungen ermöglichte. Die SWB wurden durch die Synthese von sechs halbsynthetischen Derivaten untersucht, indem ihre Zytotoxizität gegenüber Ramos B- und Jurkat T-Lymphozyten ermittelt wurde. Alle hergestellten Substanzen waren weniger aktiv als PXA, allerdings konnten anhand des Umfangs des Aktivitätsverlustes allgemein gültige SWB Aussagen getroffen werden. Weitere SWB wurden ermittelt indem die Bioaktivitäten von PXA und strukturell ähnlichen Substanzen anhand von zahlreichen Literaturquellen miteinander verglichen wurden. Zweites Projekt: Untersuchung zum schwamm-assoziierten Pilz Penicillium canescens Die Ergebnisse des zweiten Projekts liegen als veröffentlichungsfertiges Manuskript vor und umfassen Kapitel 4 (Bromierte Azaphilone aus dem schwamm-assoziierten Pilz Penicillium canescens). Der Pilz P. canescens wurde aus dem inneren Gewebe des Mittelmeerschwammes Agelas oroides isoliert. Der EtOAc Extrakt der initialen Fermentation auf festem Reismedium zeigte vielversprechende zytotoxische und anti-Tuberkulose-Aktivität. Chromatographische Untersuchungen des Extraktes führten zur Isolierung eines neuen, chlorierten Diphenylether (Penicanether) und von dreizehn bekannten Verbindungen. Die meisten isolierten Verbindungen waren als Zwischenprodukte der Griseofulvin Biosynthese einzuordnen. Das Hinzufügen von 5% NaBr zum Reismedium veränderte das Sekundärmetabolitmuster und führte zu einer starken Akkumulation von nicht-chlorierten Benzophenonen und Xanthonen, einschließlich des zuvor nicht nachgewiesenen 1,3,5,6-Tetrahydroxy-8-methylxanthons. Obwohl die Griseofulvinmenge stark reduziert war und keine Bromo-Analoga des Griseofulvins nachgewiesen wurden, konnten zwei neuartige bromierte Azaphilone (Bromophilone A und B) isoliert werden. Die Strukturen aller neuen Verbindungen wurden durch den Einsatz von 1D und 2D NMR Experimenten und Hochauflösungsmassenspektrometrie (HRMS) eindeutig aufgeklärt und die relativen Konfigurationen von Bromophilon A und B wurden durch Kern-Overhauser-Effekt (NOE) Experimente und den detailierten Vergleich der 13C chemischen Verschiebungen mit Literatur bestimmt. Hierbei stellte sich heraus, dass es sich bei Bromophilon A und B um Epimere handelt. Bromophilon B zeigte Zytotoxizität gegenüber der Maus Lymphom Zelllinie L5178Y (IC50 8.9 µM) und der menschlichen Ovarialkarzinom Zelllinie A2780 (IC50 2.7 µM), während das Epimer Bromophilon A deutlich weniger aktiv war. Drittes Projekt: Untersuchungen zum schwamm-assoziierten Pilz Aspergillus ochraceus Die Ergebnisse des dritten Projektes wurden 12/2018 bei Marine Drugs eingereicht und umfassen Kapitel 5 (Kryptische Sekundärmetaboliten des schwamm-assoziierten Pilzes Aspergillus ochraceus). Der Pilz A. ochraceus wurde aus dem inneren Gewebe des Mittelmeerschwammes Agelas oroides isoliert. Der EtOAc Extrakt der initialen Reismediumsfermentation zeigte vielversprechende zytotoxische und anti-Tuberkulose Aktivität und ein interessantes chromatographisches Profil. Die Untersuchungen des Hauptextraktes führte zur Isolation von sechzehn bekannten Verbindungen, welche sich hauptsächlich aus Ochratoxin A, Penicillinsäure (PS) Derivaten, Tryptophan-basierten Alkaloiden (Circumdatine) und Polyketid Pigmenten (z.B. Viomellein) zusammensetzen. Die Akkumulation dieser Metaboliten ließ sich durch die Zugabe von diversen anorganischen Halogenid- und Stickstoff-Salzen beeinflussen. Eine Fermentation auf Bohnen statt auf Reis führte zur Entdeckung des neuen Diketopiperazin-Alkaloids Waspergillamid B, welches sich durch seinen ungewöhnlichen p-Nitrobenzoesäurebaustein auszeichnet. Co-Kultivierung mit Bacillus subtilis ergab die zwei neuen PS-Derivate Ochraspergillsäuren A und B, welche augenscheinlich Produkte einer bakteriell-pilzlich gemischten Biosynthese sind. Ochraspergillsäure A wurde ebenfalls in axenischer Pilzkultur produziert, nachdem Tryptophan oder Anthranilsäure zugefüttert wurden. Die Strukturen der neuen Verbindungen wurden durch 1D und 2D NMR Experimente und HRMS aufgeklärt. Die absolute Konfiguration von Waspergillamid B wurde durch Hydrolyse und anschließende Umsetzung der resultierenden Aminosäuren mit Marfey Reagenz ermittelt. Die Verbindungen Viomellein und Ochratoxin B zeigten starke Zytotoxizität gegenüber der menschlichen Ovarialkarzinom Zelllinie A2780 mit IC50 Werten von jeweils 5.0 und 3.0 μM.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Dokument erstellt am:	18.05.2020
Dateien geändert am:	18.05.2020
Promotionsantrag am:	09.01.2019
Datum der Promotion:	18.03.2019