Dokument: Massenspektrometrische Untersuchungen zur Charakterisierung des Verdauverhaltens des 20S Proteasoms bei Pulmonaler Alveolarproteinose
| Titel: | Massenspektrometrische Untersuchungen zur Charakterisierung des Verdauverhaltens des 20S Proteasoms bei Pulmonaler Alveolarproteinose | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=48945 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20190321-083336-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Märthesheimer, Axel [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Bauer, Inge [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Decking, Ulrich [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Zusammenfassung:
Die pulmonale Alveolarproteinose (PAP) ist eine sehr seltene Lungenerkrankung mit Beeinträchtigung des pulmonalen Gasaustauschs, die sich durch dysfunktionale Alveolarmakrophagen und intraalveoläre Akkumulation v. a. von Surfactantproteinen (SP) und humanem Serumalbumin (HSA) darstellt. Im Alveolarraum von PAP-Patienten befindet sich enzymatisch aktives extrazelluläres Proteasom in einer Konzentration, die 10-fach über der von Lungengesunden liegt. Ziel war es, von einem PAP-Patienten gewonnene broncho-alveoläre Lavageflüssigkeit (PAP-BALF) im Hinblick auf die Proteinzusammensetzung und die Proteasomaktivität zu charakterisieren. Weitere Ziele waren, die Aktivität und Spezifität von 20S Proteasom bei der Degradation alveolärer Proteine in vitro zu untersuchen, um seine potentielle Rolle bei PAP zu erforschen. Daraus leiteten sich als methodische Ziele die Entwicklung bzw. Anwendung zweier Testsysteme ab: Erstens die Anwendung eines Testsystems zur Quantifizierung von Enzymaktivitäten und zweitens die Entwick-lung und Anwendung eines Testsystems zur proteasomalen Proteindegradation in vitro mit Charakterisierung der Produkte. Dazu erfolgte exemplarisch an einer PAP-BALF erstens die massenspektrometrische Identifikation der am häufigsten exprimierten Proteine mit Bestimmung des Oxidationsstatus und zweitens die Quantifizierung der drei klassischen Aktivitäten des enthaltenen Proteasoms durch Messung des Substratumsatzes fluorogener Peptide. In vitro wurden Insulin und HSA in nativer und denaturierter Form mit 20S Proteasom inkubiert und die entstandenen Degradationsprodukte massenspektrometrisch charakterisiert. Auch der Einfluss von Proteinoxidation und Hitzeschockprotein 90 (Hsp90) auf die proteasomale Degradation wurde studiert. Insulin und HSA in ihrer nativen Form wurden nicht durch 20S Proteasom verdaut. Erst das Aufbrechen von Sekundär- und Tertiärstrukturen machte sie zu Substraten des 20S Proteasoms bei HSA in gesteigertem Maß, wenn es zusätzlich oxidiert wurde. Das Schnittverhalten des 20S Proteasoms war substratabhängig und wurde durch Proteinoxidation bzw. Hsp90 moduliert. In bis zu 50 % der Fälle wurden in vitro atypische Schnittstellen beobachtet, die nicht mit den drei klassischen Proteasomaktivitäten in Einklang stehen. Die exemplarische Untersuchung einer PAP-BALF, bei der 9 prominente Proteine (darunter SP-A, SP-B, HSA) identifiziert wurden, lieferte Hinweise auf eine in vivo bereits bestehende Teiloxidation der alveolären Proteine als Indiz für gesteigerten oxidativen Stress bei PAP. Sie zeigte außerdem trypsin-, chymotrypsin- und caspaseartige Aktivität mit einem für Immuno 20S Proteasom (i20S) charakteristischen Profil. Verglichen mit Gesunden war die Aktivität vermindert, mutmaßlich verursacht durch einen endogenen Proteasominhibitor. Die Ergebnisse deuten auf eine Coexistenz von enzymatisch aktivem i20S Proteasom und oxidierten Proteinen im Alveolarraum von PAP-Patienten hin und lassen eine aktive Rolle des Proteasoms im Krankheitsverlauf der PAP vermuten. Die vorliegende Arbeit erweitert die Erkenntnisse zur Funktion von 20S Proteasom, sowie speziell zum extrazellulären alveolären Proteasom bei PAP und liefert erste Anhaltspunkte für dessen potentielle Rolle. In weiteren Studien sollten diese Ergebnisse an repräsentativen Fallzahlen verifiziert und die potentiellen Aufgaben des (i)20S Proteasoms bei PAP detaillierter untersucht werden. ---------------------------------------------Abstract: Pulmonary Alveolar Proteinosis (PAP) is a very rare lung disease with impaired pulmonal gas exchange. Characteristics are dysfunctional alveolar macrophages and alveolar accumulation of proteins expecially surfactant proteins (SP) and human serum albumin (HSA). The alveolar space in PAP-patients contains enzymatically active extracellular proteasomes in a 10-fold higher concentration compared to healthy subjects. The aim was to investigate the protein content and the enzymatic activity of one bronchoalveolar lavage sample in PAP (PAP-BALF). Additionally, characteristics of proteasomal degradation of alveolar proteins in vitro should be examined to investigate its role in PAP. Two suitable techniques were required: one technique for measuring enzymatic activity was utilized and one technique for analysing proteasomal degradation in vitro and the products of this process was developed and established. One PAP-BALF sample was used exemplarily to identify the most abundant proteins and their degree of oxidation by mass spectrometry. Fluorimetric substrates were applied to quantify the proteasomal activity of this sample. The proteasomal degradation of native structured and denatured proteins (Insulin and HSA) was studied and the degradations products were identified by mass spectrometry. The effects of protein oxidation and heatshock protein 90 (Hsp 90) on proteasomal degradation were also explored. The 20S proteasome was unable to degrade insulin and HSA as long as the proteins kept their native structure. Only after breaking their secondary and tertiary structures they got suitable substrates for the proteasome. Additionally oxidative modification of HSA increased the degradation rate. The degradation behaviour of the 20S proteasome depended on the substrate protein. Oxidation of proteins and the presence of Hsp90 generated different cleavage sites. Fifty percent of the proteasomal cuts took place on unexpected cleavage sites which are normally not chosen by proteasomes. The study on an exemplary PAP-BALF sample identified 9 proteins (e.g. SP-A, SP-B, HSA) that all showed oxidative modifications. These findings lead to the assumption that alveolar proteins are generally oxidized in case of PAP and that there is advanced oxidative stress in PAP. The sample also showed trypsin like, chymotrypsin like and caspase like activity comparable to immuno 20S proteasome (i20S). Activity was lower compared to healthy subjects maybe caused by an endogenous proteasom inhibitor. These findings suggest a coexistence of enzymatic active i20S proteasome and oxidative modified proteins in the alveolar space in PAP. Alveolar proteasome in PAP may play a role in pathogenesis and progression of the disease. The data extends the knowledge of the function of 20S proteasome and gives first indications of its potential function in PAP. More research on a representative number of cases is needed to proove these findings. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 21.03.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 21.03.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 18.01.2018 | |||||||
| Datum der Promotion: | 29.01.2019 |
