Dokument: Characterization of ABCG30 and ABCG1 from Arabidopsis thaliana

Titel:	Characterization of ABCG30 and ABCG1 from Arabidopsis thaliana
Weiterer Titel:	Charakterisierung von ABCG30 und ABCG1 aus Arabidopsis thaliana
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=48718
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190301-084414-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Shanmugarajah, Kalpana [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 36,29 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 28.02.2019 / geändert 28.02.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Lutz Schmitt [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Im Vergleich zu anderen Organismen besitzen Pflanzen, mit zum Beispiel 130 ABC Proteinen in Arabidopsis thaliana, eine besonders hohe Anzahl an ABC Transportern. Durch bisherige Studien wurde verdeutlicht, dass ABC Transporter wesentlich zur Fitness und dem Wachstum von Pflanzen beitragen. Jedoch wurden die meisten Studien an transgenen oder Mutanten Pflanzen durchgeführt, wohingegen direkte funktionelle Assays zur eindeutigen Substratidentifizierung noch relativ selten sind. Dabei könnten geeignete in vitro Systeme einen weiteren Einblick in die Pflanzenphysiologie und die Analyse auf molekularer Ebene ermöglichen. In dieser Dissertation wurden zunächst Studien zur Klonierung und heterologen Expression von ausgewählten ABCG Genen aus Arabidopsis thaliana durchgeführt. Dabei konnte die methylotrophe Hefe Pichia pastoris als alternatives Expressionssystem für pflanzliche ABC Transporter eingeführt werden. Die korrekte subzelluläre Lokalisierung von den erfolgreich in Pichia pastoris exprimierten sogenannten „full-size“ Transportern AtABCG36, AtABCG30 und dem „half-size“ Transporter AtABCG1 deutete auf eine korrekte Faltung und Prozessierung dieser Membranproteine hin. Im zweiten und wesentlichen Teil dieser Arbeit wurden Reinigungsprotokolle und funktionelle Untersuchungen für die Charakterisierung von AtABCG30 und AtABCG1 etabliert. Erste Solubilisierungs- und Reinigungsversuche von AtABCG30 wurden durchgeführt und lieferten eine geeignete Basis für weitere Studien. Darüber hinaus wurde AtABCG1 durch die Optimierung von Expression- und Reinigungsbedingungen in einem funktionell und aktivem Zustand aufgereinigt. Es wurde untersucht ob AtABCG1 an der Suberin Formation beteiligt ist, da es zum einen von derselben phylogenetischen Unterklasse wie die potentiellen Suberin-Vorstufen Transporter AtABCG2, AtABCG6 und AtABCG20 stammt. Zum anderen besitzt AtABCG1 eine hohe Sequenzidentität (74%) zu einem weiteren potentiellen Suberinmonomer Transporter, ABCG1 aus Solanum tuberosum. Funktionelle Untersuchungen mit gereinigtem AtABCG1 und zusätzliche phänotypische Analysen mit atabcg1 Mutanten Pflanzen deuteten auf eine Beteiligung von AtABCG1 in der Suberinsynthese in Arabidopsis Wurzeln. Dabei wurden C20-C24 α, ω- Dicarbonsäuren und das C24 Fettalkohol als potentielle AtABCG1 Substrate identifiziert. Das C26 Fettalkohol, und die Fettsäuren C24 und C26 wurden über beide Assays als AtABCG1 Substrate identifiziert. Im letzten Teil dieser Dissertation wurde ein Nachweis über die Funktion eines vesikulären Transport Assays vorgestellt. Da beide Transporter AtABCG30 und AtABCG1 unter anderem auch in den Wurzeln exprimiert sind, ist eine Funktion im Transport von Wurzelexudaten nicht auszuschließen. Vesikuläre Transport Assays stellen eine geeignete Alternative für die Identifizierung von transportierten Substraten aus einer Substratmischung wie zum Beispiel Wurzelexudaten dar. Durch die Verwendung des ABC Transporters Pdr5 aus Saccheromyces cerevisiae wurde die Etablierung eines Massenspektrometrie-basierten vesikulären Transport Assays erfolgreich durchgeführt. Folglich können zukünftige Studien an Hefe exprimierten Pflanzen ABC Transportern auch auf dieser Methode zurückgreifen. Compared to other organisms, ABC transporters are particularly abundant in plants with for instance, 130 ABC proteins in Arabidopsis thaliana. Various studies emphasized the contribution of plant ABC transporters to its fitness and growth. However, most plant ABC transporters were analyzed by transgenic or mutant plant studies and unambiguous identification of transported substrates by direct functional assays are still rare. Suitable in vitro systems would enable to gain more insight into the plant physiology and analysis on molecular level. In this thesis, cloning and expression studies of selected Arabidopsis ABCG genes resulted in introduction of the methylotrophic yeast Pichia pastoris as expression system for plant ABC transporters. The correct subcellular localization of the successfully expressed full size transporters AtABCG36, AtABCG30 and the half-size transporter AtABCG1 indicated that the proteins were properly folded and processed. The second and main part of this thesis comprised the optimization of purification protocols and functional assays for characterization of AtABCG30 and AtABCG1. Initial solubilization studies and a first purification attempt of AtABCG30 provide a proper foundation for future studies. Moreover, optimization of expression and purification conditions enabled the attainment of AtABCG1 in functional, active state. It was analyzed whether AtABCG1 is involved in root suberin formation, as it originates from the same phylogenetic tree like potential suberin precursor transporters AtABCG2, AtABCG6 and AtABCG20. Additionally, AtABCG1 and another potential suberin transporter, ABCG1 from Solanum tuberosum, share a sequence identity of 74 %. Functional assays with purified AtABCG1 as well as phenotypic analyses of atabcg1 mutant plants indicated an involvement in suberin barrier formation in the roots. Thereby, C20-C24 α, ω- dicarboxylic acids and C24 fatty alcohols were identified by mutant plant studies as putative substrates, whereas C26 fatty alcohols, C24 and C26 fatty acids were identified unambiguously by both, direct functional and mutant plant studies, as the AtABCG1 substrate. The last part of this thesis comprised of a proof-of-principle for a vesicular transport assay. As reported in previous studies, AtABCG30 as well as AtABCG1 were found to be expressed in the roots and in particular atabcg30 mutant studies indicated an involvement in root exudation. Vesicular transport assays form an alternative option for identification of transported substrates from a mixture of potential substrates, such as root exudates. The Saccharomyces cerevisiae ABC transporter Pdr5 was successfully used to establish a mass-spectrometry based vesicular transport. Hence, this assay can be transferred to future functional studies of heterologously expressed plant ABC transporter in yeast.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	01.03.2019
Dateien geändert am:	01.03.2019
Promotionsantrag am:	19.11.2018
Datum der Promotion:	16.01.2019