Dokument: Wirkung neuer Histondeacetylase-Inhibitoren auf Urothelkarzinom-Zelllinien
| Titel: | Wirkung neuer Histondeacetylase-Inhibitoren auf Urothelkarzinom-Zelllinien | |||||||
| Weiterer Titel: | Effect of novel HDAC-Inhibitors on urothelial carcinoma cells | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=48664 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20190227-084236-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Kaletsch, Aline [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Wolfgang A. Schulz [Gutachter] Gerhard Fritz [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Zusammenfassung
Histondeacetylasen (HDACs) sind eine Gruppe von Enzymen (Klasse I-IV), die an verschiedenen zellulären Prozessen wie Differenzierung, Apoptose und Proliferation beteiligt sind. In unterschiedlichem Maße wirken die verschiedenen Enzyme tumorwachstums-fördernd oder -hemmend. Da HDACs in Tumorzellen häufig fehlreguliert sind, stellen sie ein vielversprechendes Ziel für die Tumortherapie dar. Die meisten HDAC- Inhibitoren (HDACis) sind jedoch Pan-Inhibitoren und haben den Nachteil eines breiten Nebenwirkungsspektrums. Sie können durch die Hemmung einer Vielzahl von Isoenzymen nicht nur in potentiell tumorfördernde, sondern auch in tumorhemmende Mechanismen eingreifen. Daher könnten HDACis mit höherer Selektivität besser für die Tumortherapie geeignet sein. Diese Dissertation sollte dazu beitragen, ein optimales HDAC-Inhibitionsprofil für die Behandlung des Urothelkarzinoms (UC) zu definieren. In Urothelkarzinom-Zelllinien (UCCs) wurde in vorausgegangenen Studien eine verminderte mRNA- und Proteinexpression von HDAC4 (Klasse IIa) im Vergleich zu benignen Urothelzellen nachgewiesen. Deshalb sollte mit Hilfe selektiver Klasse IIa HDACis untersucht werden, ob diese überhaupt eine Wirkung auf Tumorzellen ausüben und somit eine Inhibition der Klasse IIa HDACs in der Therapie von Harnblasenkarzinomen sinnvoll ist. Mittels der HDACis 19e, 19h, 19i, LMK163 und LMK214 wurde eine pharmakologische Inhibition an den UC-Zelllinien sowie an nicht-malignen Kontrollzellen durchgeführt. Zelluläre Effekte der Inhibition wurden mittels Analysen der Vitalität, Klonogenität und Seneszenz untersucht. Auswirkungen auf den Zellzyklus wurden anhand von fluoreszenzmarkierter Durchflusszytometrie (FACS), nukleäre Veränderungen mittels zytochemischer Färbung (DAPI) detektiert. Die mRNA- und Protein-Expression spezifischer Marker der Klasse IIa HDACs wurden mit Hilfe von quantitativer Realtime-PCR und Western Blots bestimmt. Der HDACi 19i hemmte die Proliferation der UCCs bereits im niedrigen Konzentrationsbereich (IC50 0,97-1,03 μM) stark und induzierte teilweise Apoptose; die anderen HDACis wirkten bei etwas höheren Konzentrationen. Die IC50-Werte und das biologische Wirkspektrum von 19i ähnelten dem des Pan-Inhibitor Vorinostat (SAHA). Die Durchflusszytometrie ergab eine Störung im Zellzyklusverlauf mit einer erhöhten Anzahl an Zellen in der G2/M-Phase. Gleichzeitig wurden mit ansteigenden 19i-Konzentrationen vermehrt Micronuklei detektiert. Die Fähigkeit zur Koloniebildung wurde vermindert. Die mRNA-Expression von Thymidylat-Synthase und HDAC7 war nach Behandlung in allen UCCs verringert, die von p21CIP1 stark erhöht. Die Expression von HDAC4 mRNA stieg nach Behandlung leicht, die von HDAC5 stark an. Die Acetylierung von Histon H3 und H4 sowie α- Tubulin nahm konzentrationsabhängig zu, ebenso die Spaltung von PARP. Eine Überexpression von HDAC4 führte in stabil transduzierten VM-CUB1 UCC im unbehandelten Zustand zu einer verminderten Proliferationsfähigkeit. Die zellulären Effekte von 19i entsprechen im hier verwendeten Konzentrationsbereich denen einer Klasse I Inhibition. In einem Großteil der Versuche war die molekulare Wirkung an UCCs stärker als die der Referenzsubstanz SAHA. Die ursprünglich beschriebene Selektivität von 19i für HDAC4 und 5 konnte anhand unserer Experimente nicht bestätigt werden. Erneute in-vitro Analysen zur Spezifität des Inhibitors 19i ergaben tatsächlich ein zum angenommen Ausgangsprofil verändertes Wirkspektrum mit vorrangiger Aktivität gegen die HDAC Isoformen 1, 2, 3, 6 und 10; eine signifikante Aktivität gegen HDAC4 konnte nicht nachgewiesen werden. Daher ist mit diesem Inhibitor eine Aussage zur Sinnhaftigkeit der Klasse IIa Inhibition in UCCs für ein optimales HDAC-Inhibitionsprofil nicht möglich. Allerdings geben die verminderte Grundexpression in vielen UCCs und die eingeschränkte Proliferationsfähigkeit nach HDAC4-Überexpression Grund zur Annahme, dass HDAC4 das Wachstum von UCCs einschränkt und eine selektive Inhibition somit kontraproduktiv für die Tumortherapie wäre. Eine selektive Inhibition sollte daher mittels selektiverer Klasse IIa HDACis überprüft werden.Summary Histone deacetylases (HDACs) are a group of enzymes (class I-IV) which are involved in a number of important cellular processes such as differentiation, apoptosis and proliferation. Since HDACs are often dysregulated in tumor cells they are promising targets for anti-cancer drugs which could be used for the treatment of urothelial carcinoma (UC). However, most HDAC inhibitors (HDACis) are pan inhibitors and have the disadvantage of a broad spectrum of side effects in cancer therapy. Further, as individual HDACs may also promote antineoplastic processes, they may be hampered by the use of HDACis as well. Therefore, inhibition of individual enzymes could be more efficacious. The aim of this study was to help defining an optimal HDAC inhibition profile for the treatment of urothelial carcinoma (UC). In previous work we observed diminished mRNA- and protein HDAC4 expression in some urothelial carcinoma cell lines (UCCs) compared to normal urothelial cells. Hence, we investigated novel HDACis with presumed preferential activity against HDAC4/5 to determine whether they exert any effect on tumor cells and thus inhibition of class IIa HDACs is useful or counterproductive in the therapy of bladder cancer. We used novel HDACis 19e, 19h, 19i, LMK163 and LMK214 on UC cell lines with basal expression of HDAC4, HDAC4 overexpressing UC cell lines and benign control cells. UC cell lines overexpressing HDAC4 were established by lentiviral transduction. IC50s for HDACi were determined by MTT assay. Cellular effects were analyzed by colony forming assay, caspase-3/7 assay, senescence assay and immunofluorescence staining. Cell cycle effects were assessed by flow cytometry. Molecular changes were followed by quantitative real-time PCR and Western blots. Treatment with class I HDACi SAHA served as a control. 19i significantly reduced proliferation of all UC cell lines at low micromolar concentrations (IC50 0,97-1,03 μM); the other HDACis were less efficacious. Control lines were similarly or less sensitive. The IC50 values and biological spectrum of 19i were similar to those of the pan inhibitor vorinostat (SAHA). At 1 or 2 μM, 19i revealed a disruption in cell cycle progression with an increased number of cells in G2/M-fraction, inhibited clonogenic growth, induced caspase activity, disturbed mitosis and elicited apoptosis, micronuclei and senescence in some cells. Thymidylate synthase expression was diminished, p21CIP1 was induced; global histone acetylation and α-tubulin acetylation increased in a concentration-dependent manner, as did the cleavage of PARP. In most cell lines, 19i induced HDAC4 and HDAC5 mRNAs while rather repressing HDAC7. VM-CUB1 cell lines overexpressing HDAC4 proliferated more slowly and were not significantly less sensitive to 19i. Our data suggest that anti-neoplastic effects of 19i on UCCs appear to be exerted by targeting class I HDACs. However, treatment with 19i resulted in stronger cellular effects than treatment with SAHA. The presumed preferential activity against class IIa HDAC4 and 5 could not be confirmed by our experiments. Reevaluation of in vitro HDAC isoenzyme activity inhibition profile of 19i and its docking to HDAC4 using current assays revealed a superior activity of 19i against the HDAC isoforms 1, 2, 3, 6 and 10; a significant activity against HDAC4 could not be detected. Therefore, a conclusion concerning the use of class IIa HDACis for the treatment of UC is not possible with 19i. However, the reduced basal expression levels of HDAC4 in UCCs and the decreased proliferative capacity of HDAC4 overexpressing cells suggest that HDAC4 may impede UC growth. A class IIa inhibition should thus be examined with more selective class IIa inhibitors. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 27.02.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 27.02.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 08.09.2018 | |||||||
| Datum der Promotion: | 21.02.2019 |
