Dokument: Catalytically active inclusion bodies: A novel enzyme immobilization method for biocatalysis

Titel:	Catalytically active inclusion bodies: A novel enzyme immobilization method for biocatalysis
Weiterer Titel:	Katalytisch aktive Inclusion Bodies: Eine neue Enzymimmobilisierungsmethode für die Biokatalyse
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=48534
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190215-092613-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kloß, Ramona [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 86,79 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.02.2019 / geändert 11.02.2019
Beitragende:	PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In the last decades, biocatalysis gained in importance for the production of valuable fine chemicals and pharmaceuticals due to high regio-, chemo-, and stereoselectivity. The demands on biocatalysts for application in organic synthesis and technical processes are high in terms of handling, productivity and stability. These requirements can be fulfilled by immobilization of the enzyme, which furthermore enables the easy separation and recycling of the biocatalyst. Many immobilization methods require previous (chromatographic) enzyme purification steps followed by additional steps e.g. to fix the enzyme on the surface of a carrier. As generic methods are missing, a case-to-case optimization is necessary, making immobilization methods often time-consuming and laborious. As an alternative, an easy, carrier-free and generic method would be desirable. In this thesis catalytically active inclusion bodies (CatIBs) were investigated as an alternative carrier-free and cell-free immobilization strategy and tested for the application in biocatalysis. Since enzyme production is combined with immobilization directly in the bacterial production cell, only few steps are necessary to obtain the lyophilized biocatalyst. The CatIBs were created by fusion of the respective target enzyme to aggregation-inducing tags containing an aggregation-prone part. Two of these tags, forming a coiled-coil domain, were comparatively studied, namely one from the cell-surface protein tetrabrachion (TDoT) from hyperthermophilic archaeon Staphylothermus marinus and the 3HAMP domain (Histidine kinases, Adenylyl cyclases, Methyl-accepting chemotaxis proteins (MCPs), and Phosphatases) from P. aeruginosa soluble receptor Aer2. The easy production of different CatIBs was enabled by using a modular expression vector and a simple isolation protocol including only cell disruption and one washing step. CatIBs were shown to be generally applicable to a broad spectrum of enzymes of different complexity. In this thesis, the CatIB toolbox was successfully enlarged by two NADPH-dependent alcohol dehydrogenases from Ralstonia sp. (RADH) and from L. brevis (LbADH), two thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzymes, benzaldehyde lyase from P. fluorescens Biovar I (PfBAL) and benzoyl¬formate decarboxylase from P. putida (PpBFD), and the pyridoxal 5'-phosphate-dependent constitutive lysine decarboxylase from E. coli (EcLDC). The CatIBs produced by fusion to either the TDoT-domain or the 3HAMP-domain differed concerning compactness of the particles, solubility, yield, activity, lipid, and protein content. Their morphology in E. coli cells differed between compact-packed or diffuse particles as observed in the microscope in phase-contrast. By means of molecular biological methods, the efficiency to produce CatIBs could be improved, such as changing the fusion site and using a different coiled-coil domain, which enables the fine-tuning of the CatIB properties for the required application. Both kinds of CatIBs showed differences in their applicability and stability in biocatalytic reaction systems. CatIBs could be successfully applied in different reactions systems such as (repetitive) batch and a continuously operated enzyme membrane reactor (EMR) in buffer, as well as in monophasic and biphasic aqueous-organic reaction systems. They showed a good reusability and stability under several reaction conditions. Finally, CatIBs were successfully applicable for the production of high valuable products under technical conditions in culture supernatants of a C. glutamicum L-lysine producer strain at L-lysine concentrations of up to 1 M in repetitive batch as well as batch experiments. Furthermore, PfBAL-CatIBs could be used for the carboligation of up to 85 mM benzaldehyde and derivatives in biphasic reaction system as well as for the continuous production of 30 mM (R)-2-hydroxy-1-phenylpropanone, a valuable precursor and building block for pharmaceuticals. In den letzten Jahrzehnten hat die Biokatalyse aufgrund der hohen Regio-, Chemo- und Stereoselektivität an Bedeutung für die Herstellung wertvoller Feinchemikalien und Pharmazeutika gewonnen. Die Anforderungen an Biokatalysatoren für den Einsatz in der organischen Synthese und in technischen Prozessen sind hoch in Bezug auf Handhabung, Produktivität und Stabilität. Durch die Enzymimmobilisierung können diese Anforderungen erfüllt werden, was zudem eine einfache Trennung und Wiederverwertung des Biokatalysators ermöglicht. Viele Immobilisierungsmethoden erfordern vorherige (chromato-graphische) Enzymreinigungsschritte, gefolgt von zusätzlichen Schritten, z. B. das Enzym auf der Oberfläche eines Trägers zu fixieren. Da generische Methoden fehlen, ist eine individuelle Optimierung notwendig, was die Immobilisierung oft zeit- und arbeitsaufwändig macht. Als Alternative wäre eine einfache, trägerfreie und generische Methode wünschenswert. In dieser Arbeit wurden katalytisch aktive Einschlusskörper (CatIBs) als alternative träger- und zellfreie Immobilisierungsstrategie untersucht und für den Einsatz in der Biokatalyse getestet. Da die Enzymproduktion mit der Immobilisierung direkt in der bakteriellen Produktionszelle kombiniert wird, sind nur wenige Schritte notwendig, um den lyophilisierten Biokatalysator zu erhalten. Die CatIBs wurden durch Fusion des jeweiligen Ziel-Enzyms mit einem Aggregations-induzierenden Protein erstellt. Zwei dieser Tags, die eine coiled-coil Domäne bilden, wurden vergleichend untersucht, nämlich das Zelloberflächenprotein Tetrabrachion (TDoT) aus dem hyperthermophilen Archäon S. marinus und die 3HAMP-Domäne (Histidin-Kinasen, Adenylyl-Cyclasen, Methyl-akzeptierende Chemotaxis-Proteine (MCPs) und Phosphatasen) des löslichen Rezeptors Aer2 von P. aeruginosa. Die einfache Herstellung verschiedener CatIBs wurde durch die Verwendung eines modularen Expressionsvektors und eines einfachen Isolationsprotokolls ermöglicht, das neben dem Zellaufschluss nur einen Waschschritt umfasst. CatIBs erwiesen sich als allgemein anwendbar für ein breites Spektrum von Enzymen unterschiedlicher Komplexität. In dieser Arbeit wurde die CatIB-Toolbox erfolgreich um zwei NADPH-abhängige Alkoholdehydrogenasen aus Ralstonia sp. (RADH) und aus L. brevis (LbADH), zwei Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängige Enzymen, Benzaldehydlyase aus P. fluorescens Biovar I (PfBAL) und Benzoylformiatdecarboxylase aus P. putida (PpBFD) und die Pyridoxal-5'-phosphat-abhängige, konstitutive Lysindecarboxylase aus E. coli (EcLDC) erweitert. Die durch Fusion zur TDoT-Domäne oder zur 3HAMP-Domäne erzeugten CatIBs unterschieden sich hinsichtlich Kompaktheit der Partikel, Unlöslichkeit, Ausbeute, Aktivität, Lipid- und Proteingehalt. Ihre Morphologie in E. coli Zellen variiert zwischen kompakt gepackten oder diffusen Partikeln, wie im Mikroskop im Phasenkontrast beobachtet wurde. Mit Hilfe molekularbiologischer Methoden konnte die Effizienz bei der Herstellung von CatIBs verbessert werden, z. B. durch Änderung der Fusionsstelle und Verwendung einer anderen coiled-coil Domäne, was die Feinanpassung der CatIB-Eigenschaften für die gewünschte Anwendung ermöglicht. Beide Arten von CatIBs zeigten Unterschiede in ihrer Anwendbarkeit und Stabilität in biokatalytischen Reaktionssystemen. CatIBs konnten erfolgreich in verschiedenen Reaktions-systemen wie (repetitiven) batch und einem kontinuierlich betriebenen Enzym-Membran-reaktor (EMR) im Puffer sowie in monophasischen und biphasischen wässrig-organischen Reaktionssystemen eingesetzt werden. Sie zeigten eine gute Wiederverwendbarkeit und Stabilität unter verschiedenen Reaktionsbedingungen. Schließlich wurden CatIBs für die Herstellung von hochwertigen Produkten unter technischen Bedingungen in Kulturüberständen eines C. glutamicum L-Lysin Produzentenstammes bei L-Lysin-Konzentrationen von bis zu 1 M in repetitiven batch und batch Experimenten erfolgreich eingesetzt. Darüber hinaus konnten PfBAL-CatIBs zur Carboligation von bis zu 85 mM Benzaldehyd und dessen Derivaten in biphasischen Reaktionssystemen sowie zur kontinuierlichen Herstellung von 30 mM (R)-2-Hydroxy-1-phenylpropanon, einem wertvollen Vorläufer und Baustein für Arzneimittel, eingesetzt werden.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	15.02.2019
Dateien geändert am:	15.02.2019
Promotionsantrag am:	05.06.2018
Datum der Promotion:	12.07.2018