Dokument: Strcutural and biophysical characterization of the human serotonin transporter

Titel:	Strcutural and biophysical characterization of the human serotonin transporter
Weiterer Titel:	Strukturelle und biophysikalische Charakterisierung des humanen Serotonintransporters
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=48497
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190211-150335-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Worms, Daniel [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 20,92 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.02.2019 / geändert 06.02.2019
Beitragende:	Prof.Dr. Labahn, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. Heise, Henrike [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Serotonin is a neurotransmitter and paracrine hormone that regulates a wide range of biological processes in humans through interaction with specific receptors. It affects the cardiovascular system, the nervous system and the gastrointestinal tract. The serotonin transporter translocate serotonin molecules from the synaptic cleft into the neuron, thereby terminating the serotonin induced signal transmission. Depression in humans can be related to an imbalanced serotonin household and is currently treated with selective serotonin reuptake inhibitors. Information about the transporter’s structural data may guide the development of new antidepressants, that are superior in terms of efficacy, onset and adverse effects compared to currently available pharmaceuticals, by structure-based drug design. X-ray diffraction of protein crystals allows the determination of the structure with high resolution. However, this attempt requires a high amount of homogenous purified protein, and expression in bacterial system is much faster and less cost intensive compared to mammalian expression systems. In this study, the human serotonin transporter was recombinantly expressed from bacterial or insect cell expression system. Protein expressed in insect cells could not be stabilized during purification. Overall yield and purity of C-terminal rho-tagged hSERT expressed in E. coli was found to be low. Large-scale protein production was established for the N-terminal his-tagged human SERT in E. coli. Optimized expression conditions, solubilization and purification protocols were developed that allowed to obtain moderate yields (~1.2 mg L-1 cell culture) of high purity protein that is suitable for downstream applications. Identity of target protein was confirmed by immunoblot and mass spectroscopy. The secondary structure of FC12 purified hSERT was found to be in good agreement with known literature and could be further optimized by addition of cholesterol and a mixture of phospholipids. These additives also improved the thermal stability of E. coli expressed hSERT by ~7 °C. Results from fluorescence-based experiments were in close agreement with the results obtained from CD spectroscopy. Interaction with SSRIs or TCA led to small changes in the secondary structure content and in general to a lower thermal stability. Binding of desipramine to FC12 purified hSERT was observed during SPR spectroscopy measurements in absence of cholesterol and phospholipids. The equilibrium dissociation constant kD was determined as ~2.8 µM, showing that detergent mediated purification does not affect binding kinetics. The dissociation constant was determined assuming a 1:1 binding model, but data indicates a different stoichiometry. Fitting models that account for multiple binding sites or allosteric effects cannot describe the experimental data sufficiently. Alternatively, this can also be explained with binding of oligomeric analyte molecules. Serotonin ist ein Neurotransmitter und parakrines Hormon, das eine große Bandbreite von biologischen Prozessen im Menschen durch Interaktion mit spezifischen Rezeptoren reguliert. Es beeinflusst das kardiovaskuläre System, das Nervensystem sowie den Magen-Darm-Trakt. Der Serotonintransporter transloziert Serotoninmoleküle über die Membran aus dem synaptischen Spalt ins Innere des Neurons und beendet damit die serotonininduzierte Signalübertragung. Depression beim Menschen wird in Verbindung mit einem unausgeglichenen Serotoninhaushalt in Verbindung gebracht und lässt sich unterstützend mit Hilfe von selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmern therapieren. Informationen über die Struktur des Serotonintransporters könnte die Entwicklung neuer Medikamente ermöglichen, die den herkömmlichen Therapeutika in Bezug auf Wirksamkeit, Wirkungseintritt und unerwünschten Nebenwirkungen überlegen sind. Röntgenstrukturanalytische Untersuchungen von Proteinkristallen des Transporters ermöglichen die Bestimmung der Proteinstruktur mit hoher Auflösung. Diese Vorgehensweise benötigt allerdings verhältnismäßig große Mengen des homogen aufgereinigten Proteins und die Expression im bakteriellen System ist deutlich schneller und weniger kostenintensiv im Vergleich zur Expression mittels Säugetierzellen. In der vorliegenden Studie wurde der humane Serotonintransporter im bakteriellen System sowie in Insektenzellen rekombinant exprimiert. In Insektenzellen exprimiertes Protein konnte während der Aufreinigung nicht ausreichend stabilisiert werden. Ausbeute und Reinheit des C-Terminal rho-markierten hSERT exprimiert in E. coli waren zu gering. Die Proteinproduktion mittels E. coli im Litermaßstab wurde für N-Terminal his-markiertes hSERT etabliert. Optimierte Protokolle für Expression, Solubilisierung und Aufreinigung wurden entwickelt. Diese ermöglichten eine moderate Ausbeute an hochreinem Protein welches geeignet für nachfolgende Experimente ist. Die Identität des Zielproteins wurde mittels Immunblot und Massenspektroskopie bestätigt. Die mittels CD-Spektroskopie bestimmte Sekundärstruktur von aufgereinigtem hSERT passt gut zu den bisher bekannten Daten und konnte durch Zugabe von Cholesterol und Phospholipiden weiter verbessert werden. Diese Additive konnten auch die Thermostabilität von E. coli exprimiertem hSERT um ~7 °C verbessern. Die Ergebnisse der fluoreszene-basierten Experimente stimmen mit den Ergebnissen der CD-Spektroskopie sehr gut überein. Interaktion mit SSRIs oder TCA führt zu kleinen Änderungen der Sekundärstruktur und allgemein zu einer niedrigeren Thermostabilität. Interaktion zwischen Desipramin und FC12 aufgereinigtem hSERT in Abwesenheit von Cholesterol und Phospholipiden konnte bei SPR-spektroskopischen Messungen beobachtet werden. Die Dissoziationskonstante kD wurde mit 2.8 µM bestimmt, was darauf hindeutet, dass die Bindungskinetik nicht durch Detergens beeinflusst wird. Die Dissoziationskonstante wurde unter Annahme eines 1:1 Bindungsmodells ermittelt, wobei die vorliegenden Daten eine andere Stöchiometrie vermuten lassen. Entsprechende Regressionsmodelle, welche mehrere Bindestellen sowie allosterische Effekte berücksichtigen, können die gemessenen Daten nicht hinreichend erklären. Alternativ kann dies durch Bindung oligomerer Analytmoleküle erklärt werden.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	11.02.2019
Dateien geändert am:	11.02.2019
Promotionsantrag am:	16.11.2018
Datum der Promotion:	24.01.2019