Dokument: Untersuchung der in vitro Modulation immunkompetenter Zellen zur präklinischen Bestimmung des immunogenen Potenzials von Biologika

Titel:	Untersuchung der in vitro Modulation immunkompetenter Zellen zur präklinischen Bestimmung des immunogenen Potenzials von Biologika
Weiterer Titel:	In vitro modulation of immunocompetent cells for the preclinical assessment of immunogenicity of biologics
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=48477
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190211-092335-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Wöffen, Nicole [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,85 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.02.2019 / geändert 03.02.2019
Beitragende:	PD Dr. Vohr, Hans-Werner [Gutachter] Prof. Dr. Proksch, Peter [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Biopharmazeutika, auch als Biologika bezeichnet, haben das Potenzial im Patienten unerwünschte Immunreaktionen auszulösen (adverse drug reactions; ADRs). Diese Reaktionen können von der Reduktion der Wirksamkeit der Biopharmazeutika bis hin zu schweren, lebensbedrohlichen Nebenwirkungen reichen. Die Vorhersagbarkeit immunogener Reaktionen auf Basis präklinischer Studien ist bislang jedoch limitiert. Traditionelle Tiermodelle sind aufgrund der Xenogenität humaner Biopharmazeutika im Tier und existierender Speziesunterschiede für die Vorhersage potenzieller Immunogenität im Menschen nur begrenzt aussagekräftig. In der immuntoxikologischen Forschung ist hier die Ergänzung der in vivo Studien um geeignete humane in vitro Screening-Modelle von Interesse, um Biologika bereits in der frühen Entwicklungsphase auf ihr immunogenes Potenzial im Menschen zu untersuchen und mögliche Gefahren zu identifizieren. Eine Alternative stellt der Gebrauch speziesspezifischer Analoga von humanen Biologika, sogenannter „Surrogates“, dar. Solche Untersuchungen werden von den Behörden zwar problemlos anerkannt, sind jedoch sehr aufwendig und komplex, da alle Eigenschaften dieser Surrogate wie beispielsweise Bindungsaffinitäten und –spezifitäten, Wirksamkeit und Pharmakokinetik denen der jeweiligen Prüfmuster entsprechen müssen. Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand deshalb die Entwicklung und Evaluierung von zwei humanen in vitro Testsystemen zur Detektion immunstimulierender Wirkungen durch Biologika wie Modell-Antigene und therapeutische monoklonale Antikörper. Ziel der Untersuchungen war eine Aussage darüber zu treffen, inwiefern diese in vitro Modelle zur Identifizierung immunogener Reaktionen geeignet sind und zur Erstellung eines Immunogenitätsprofils des Arzneimittelkandidaten beitragen können. Das erste in vitro Modell adressiert ADRs in Form einer Produktion antigenspezifischer Antikörper gegen den Wirkstoff (Anti-Drug-Antikörper) als Reaktion auf die xenogenen Anteile eines Biologikums. Im Gegensatz zu in vivo Studien liegt der Fokus dieses in vitro Testsystems jedoch auf früheren Endpunkten. Es handelt sich um ein zweidimensionales Kokultursystem, bestehend aus humanen dendritischen Zellen und T-Lymphozyten, in dem die Aktivierung von dendritischen Zellen und eine darauf folgende Initiierung antigenspezifischer Reaktionen von T-Lymphozyten abgebildet werden soll. Hierfür wurde zunächst ein Protokoll zur Differenzierung dendritischer Zellen aus Monozyten des humanen Vollblutes etabliert. Nach antigenspezifischer Reifung wurden diese Zellen mit autologen CD4+ T-Lymphozyten kultiviert und die Induktion primärer und sekundärer Immunreaktionen auf das Antigen analysiert. Die Induktion einer Primärreaktion auf Biologika wie Modell-Antigene (KLH, OVA) und (therapeutische) monoklonale Antikörper konnte im Rahmen dieser in vitro Kokultur nicht eindeutig detektiert werden. Eine besondere Herausforderung stellten endotoxische Substanzverunreinigungen und zusätzlich artifiziell zugesetzte Danger-Signale (LPS) dar. In Anlehnung an die in vivo Situation induzierten diese auch in vitro primäre Immunreaktionen in Form eines veränderten Oberflächenmarkerprofils dendritischer Zellen und einer anschließend initiierten T-Zellaktivierung, ermöglichten jedoch keine Abgrenzung der antigenspezifischen von einer inflammatorischen Reaktion. Auch Substanzmodifikationen wie Aggregationen stellten in dem untersuchten in vitro Kokultursystem ein solches Danger-Signal dar und waren in der Lage primäre, inflammatorische und vermutlich auch spezifische Immunreaktionen in vitro zu induzieren. Im Gegensatz zur Primärreaktion brachte das erweiterte in vitro Kokultursystem, mit zwei Restimulationszyklen zur Analyse der Sekundärantwort auf das Modell-Antigen KLH, Tendenzen einer antigenspezifischen Reaktion hervor. Diese zeigte sich in einer verstärkten Sekretion relevanter T-Zell-Zytokine sowie im Zelltod dendritischer Zellen. Hinsichtlich der gewonnenen Ergebnisse im Rahmen der in vitro Kokultur, bedarf es noch einer Vielzahl ergänzender Untersuchungen und Modellerweiterungen, um die komplexen, immunogenen Reaktionen auf die xenogenen Anteile von Biologika zukünftig verlässlich abbilden zu können. Ein weiteres humanes in vitro Testsystem zur Detektion potenzieller Immunogenität von Biologika stellt der Cytokine Release Assay (CRA) dar. Dieser befasst sich mit dem akuten Effekt einer systemischen Zytokinfreisetzung (Cytokine Release Syndrom), welcher in der Klinik als adverse Reaktion auf therapeutische monoklonale Antikörper auftreten kann. Bis heute besteht in der Forschung kein Konsens darüber, welche Methode für eine präklinische Evaluierung am besten geeignet ist. Zur Etablierung des CRAs wurden in der vorliegenden Arbeit zwei verschiedene Assayformate untersucht: die Vollblut- und die PBMC-Methode. Während die zu testenden monoklonalen Antikörper innerhalb der Vollblut-Methode in löslicher Form zugegeben wurden, erfolgte die Präsentation an PBMCs in immobilisierter, plattengebundener Form. Für beide Methoden wurden bestmögliche Parameter ermittelt, die es ermöglichten, das bekannte klinische Potenzial der getesteten monoklonalen Antikörper zur Auslösung akuter Zytokinfreisetzungen im Patienten zuverlässig in vitro abzubilden. Die Untersuchungen zeigten zudem, dass die Wahl der Methode selbst Einfluss auf das Ausmaß der induzierten Reaktionen haben kann. Dies verdeutlicht die Wichtigkeit, eine Teststrategie in Abhängigkeit vom Wirkmechanismus und therapeutischen Anwendungsbereich des therapeutischen Antikörpers zu definieren. Antigenspezifische Reaktionen auf xenogene Anteile von Biologika stellen komplexe, immunologische Reaktionen dar, die in dem untersuchten zweidimensionalen in vitro Kokultursystem nur bedingt abgebildet werden konnten. Der im Rahmen dieser Dissertation etablierte Cytokine Release Assay hingegen erwies sich als wertvolles Screening-Tool und wird mittlerweile zur präklinischen Gefahrenidentifikation eines potenziellen Cytokine Release Syndroms eingesetzt. Biopharmaceuticals, also known as biologics, have the potential to induce unwanted immune reactions in patients termed adverse drug reactions (ADRs) resulting in not only compromised therapeutic efficacy but also potential life-threatening side effects. Until now, immunogenicity of protein therapeutics is difficult to predict in preclinical studies. Due to the xenogenic origin of human biopharmaceuticals in animals and existing species differences traditional animal models are of limited value, only. Therefore, additional human in vitro screening methods are of great interest in immunotoxicological research to investigate the immunogenic potential of biologics and to identify potential hazards already in early develompment phases. Alternatively, the use of species-specific analogous products – so called “surrogates” – can be considered in order to investigate the immunogenic potential of a drug candidate. The use of surrogates is generally accepted by regulatory agencies; however, the need to demonstrate sufficient comparability to the actual clinical molecule in all main properties (e.g. binding affinity and specificity, efficacy and pharmacokinetics) leads to higher expenditures. Here, two human in vitro test systems were evaluated for the detection of immunostimulatory reactions caused by biologics such as model antigens and therapeutical monoclonal antibodies. The main goal was the identification of potential hazards that can further contribute to preparing an immunogenicity profile of the respective biologic. The first in vitro model addresses ADRs in the form of anti-drug antibody (ADA) production resulting from the interaction of immune competent cells with biologics of xenogenic origin. Unlike existing in vivo studies, the current in vitro model is focusing on earlier endpoints within the development of immunogenicity. The model consists of a 2D-co-culture system of human dendritic cells and T lymphocytes. It detects the activation of dendritic cells as well as the following initiation of antigen-specific reactions by T cells. First of all, monocytes were isolated from human whole blood and differentiated to dendritic cells. After antigen-specific maturation, monocyte-derived dendritic cells were cultivated with autologous CD4+ T lymphocytes and the induction of primary and secondary immune response was analyzed. Evidence for the induction of primary immune reactions to biologics such as model antigens (KLH, OVA) and (therapeutic) monoclonal antibodies could not be clearly detected. Furthermore, endotoxic contaminations and artificially added danger signals (LPS) led to a significant challenge. In accordance with in vivo settings, these stimulations induced a primary immune reaction in vitro characterized by altered surface marker expression on dendritic cells followed by an initiated T cell activation. However, antigen-specific and inflammatory response could not be differentiated. Additionally, protein modification such as aggregate formation represented a danger signal to immune cells within the investigated in vitro co-culture system. Nevertheless, primary inflammatory, probably also specific immune reactions could be detected after stimulation with aggregated monoclonal antibodies. In contrast, marked effects with tendencies of an antigen-specific secondary immune reaction were detected within the extended co-culture test system after two re-stimulation cycles using the model antigen KLH. These reactions were characterized by an increased secretion of relevant T cell cytokines and dendritic cell death. Overall, further investigations are still needed to reliably detect and predict such complex immune reactions to biologics of xenogenic origin in vitro. Another human in vitro model for the detection of potential immunogenicity of biologics is the Cytokine Release Assay (CRA). This assay reflects the acute effect of systemic cytokine release (termed as Cytokine Release Syndrome), which can occur as adverse infusion-related reactions in patients during monoclonal antibody therapy. Currently, there is no consensus regarding which method is the most appropriate to evaluate preclinical safety of novel monoclonal antibody therapeutics. Therefore, two different assay formats were investigated: the Whole Blood Assay and the PBMC Assay. In the Whole Blood Assay, monoclonal antibodies are presented to cells in solution while the PBMC Assay takes place in solid-phase with immobilized antibodies. For both in vitro assays, optimal parameters were determined to reliably detect the clinically known potential of tested monoclonal antibodies to induce cytokine release in humans. Moreover, the results showed an impact of the applied assay itself on the extent of the induced reactions and therefore the importance of defining a test strategy based on the mode of action and therapeutic indication of the respective monoclonal antibody. In summary, this work showed that the investigated 2D in vitro co-culture test system seems to be of limited suitability for investigating complex antigen-specific reactions to biologics of xenogenic origin. The established Cytokine Release Assay, however, has proven to be a valuable screening tool and, now, it is applied for preclinical hazard identification of potential Cytokine Release Syndrome.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	11.02.2019
Dateien geändert am:	11.02.2019
Promotionsantrag am:	26.07.2018
Datum der Promotion:	31.08.2018