Dokument: Biochemische Charakterisierung der Komponenten des ERECTA-Signalweges

Titel:	Biochemische Charakterisierung der Komponenten des ERECTA-Signalweges
Weiterer Titel:	Biochemical characterization of the components of the ERECTA pathway
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=48353
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190123-114521-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hofmann, Alexander [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,78 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 23.01.2019 / geändert 23.01.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter] Prof. Dr. Simon, Rüdiger [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 580 Pflanzen (Botanik)
Beschreibungen:	ERECTA, ERL1 und ERL2 sind Rezeptorproteine mit cytosolischer Kinasedomäne (receptor-like-kinases, RLKs), die an einer Vielzahl von entwicklungsbiologischen Prozessen beteiligt sind. So führt ein Fehlen funktioneller Formen dieser Proteine zu verminderter Wuchshöhe und gestauchten Blütenständen im Modellorganismus Arabidopsis thaliana. Auch die Entwicklung von Spaltöffnungen wird durch sie reguliert. In direkter Interaktion mit TMM, einem Korezeptor ohne Kinasedomäne, werden von ERECTA, ERL1 und ERL2 Peptidsignale wahrgenommen, die entweder zur Entwicklung von Stomata aus noch nicht differenziertem Blattgewebe führen oder dies verhindern. EPFL9 ist ein Peptidsignal, das die Stomataentwicklung anregt und bereits umfangreich physiologisch und strukturell charakterisiert wurde. Ein weniger gut charakterisiertes Peptidsignal ist EPFL2. Darüber hinaus wird BAK1 als Korezeptor im ERECTA-Signalweg postuliert. Die Gewinnung dieser Proteine und Peptide für biochemische Analysen ist bisher sehr aufwendig, da postranslationale Modifikationen wie Disulfidbrückenbindungen und N-Glykosylierung an ihnen erreicht werden müssen. In der vorliegenden Arbeit wird ein System etabliert Proteine und Peptide in ausreichenden Mengen und Reinheit für biochemische Analysen zu gewinnen. Hierbei wird für ERECTA, ERL1, ERL2, TMM und BAK1 die N-Glykosylierung und Ausbildung korrekter Disulfidbrücken vernachlässigt und eine Expression im Wirtssystem Escherichia coli mit anschließender Affinitäschromatographie durchgeführt. Die Gewinnung von heterolog exprimiertem EPFL9 aus E. coli und die durch redox shuffling erzielte Ausprägung von funktionsimmanenten Disulfidbrücken wird reproduziert und auf EPFL2 angewandt. Mit den gewonnenen Komponenten wurde gezeigt, dass die heterolog exprimierten Rezeptoren EPFL9 und EPLF2 binden. Es konnten Dissoziations konstanten zur Interaktion mit EPFL9 und EPFL2 bestimmt und verglichen werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass der Korezeptor TMM scheinbar ohne zusätzliches Rezeptorprotein EPFL2 binden kann. Die Bindung von EPFL2 an TMM, zwei Komponenten, die noch nicht alleinstehend charakterisiert wurden, konnte über Größenausschlusschromatographie Evidenz gesammelt werden. Es wurde im Versuch an Arabidopsis thaliana gezeigt, dass das gewonnene Peptid EPFL2 Bioaktivität aufweist und negativ regulatorisch auf die Stomataentwicklung in Pflanzen wirkt. In Strukturbindungsmodellen wird ein Bindungsmodus von BAK1 an die RLKs postuliert, der sich von dem des Korezeptors TMM unterscheidet. ERECTA, ERL1 and ERL2 are receptor proteins with a cytosolic kinase domain, so called receptor-like kinases (RLKs). They are involved in numerous developmental processes. In the case of plants with deficiencies in these proteins reduced growth height and compressed floral architecture occur in the model organism Arabidopsis thaliana. The formation of stomatal complexes is also regulated by ERECTA, ERL1 and ERL2. In direct interaction with the co-receptor TMM, which lacks a cytosolic kinase domain, peptide signals are percieved leading either to the development of stomata from progenitor cells or the development of stomata is inhibited. EPFL9 is a peptide signal, which propagates stomatal development and has been characterized as well physiologically as structurally. As less well characterized peptide signal is found in EPFL2. Additionally BAK1 is hypothesized as a potential co-receptor in the ERECTA signaling way. Production of these proteins and peptides is complex and difficult, since posttranslational modifications such as N-glycosylation and the formation of disulfide bonds have to be secured. This work introduces a system to produce proteins and peptides in sufficient quantity and purity for biochemical analysis. For ERECTA, ERL1, ERL2, TMM and BAK1 the introduction of disulfide bond and N-glycosylation is neglected, since they have not been shown to be relevant parameters for protein-peptide interactions. Therefore, expression and purification from the bacterial host Escherichia coli is performed. The production of EPFL9 heterologously produced EPFL9 from E. coli and the introduction of correct disulfide bonds via redox shuffling is replicated and also applied to EPFL2. With the yielded components binding of EPFL9 and EPFL2 to the heterologously produced receptors was shown. Dissociation constants were acquired for the interaction with EPFL9 and EPFL2. Furthermore an interaction of TMM with EPFL2 could be demonstrated in the absence of a receptor protein. The binding of EPFL2 to TMM, which has not been characterized so far, was verified via size exclusion chromatography. With the application of the peptides to Arabidopsis plants, a negative regulatory role of EPFL in stomatal devolvement was demonstrated. With computational protein-protein docking a mode of binding of BAK1 to the RLKs, differing from that of TMM, was postulated.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Biochemie der Pflanzen
Dokument erstellt am:	23.01.2019
Dateien geändert am:	23.01.2019
Promotionsantrag am:	15.01.2018
Datum der Promotion:	26.02.2018